Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) Test diagnostici di Laboratorio Valeria Ghisetti e Giovanna Marchiaro S.C. Microbiologia ASO San Giovanni Battista - Molinette

WHO”global allert” Inizio anni ’80 AIDS Inizio 2003 SARS 2 anni per identificare HIV 4 settimane per SARS-CoV 2 settimane per identificare il virus 2 settimane per sequenziare il genoma e stabilire la filogenesi di SARS-CoV

WHO Regional & Country Offices WHO”global allert” marzo 2003 WHO National Disease Control Centres WHO Regional & Country Offices UN & CDC Electronic Discussions Invio di materiali biologici sangue,siero escreato tamponi faringei e nasofaringei materiale autoptico Media 13 laboratori di riferimento in 10 paesi (richiesto BSL 3) NHI mobilita 300 ricercatori del CDC

SARS-CoV: agente eziologico di SARS Ordine: Nidovirales Famiglia: Coronaviridae Genere: Coronavirus Species : SARS-CoV Virus “giganti” : Il genoma consta di ~30 000 nt HIV ~10 000 nt, HBV ~ 3 000 nt Virus ad RNA+ (RNA: mRNA) Alta variabilità genetica “corona”: proteina S legante il recettore e epitopi neutralizzanti

SARS-CoV Gruppo I Gruppo III Gruppo II Virus della gastroenterite suina Coronavirus umano229E Coronavirus della peritonite del gatto Coronavirus del cane Gruppo III Virus della bronchite degli uccelli Coronavirus dei tacchini SARS-CoV Gruppo II Virus dell’epatite dei topi Virus della sialoadenite dei ratti Virus dell’encefalite suina Coronavirus umano OC43 Coronavirus dei bovini

SARS : criteri di diagnosi Criteri clinici Criteri epidemiologici Criteri di laboratorio conferma diagnosi di SARS esclusione diagnosi di SARS CDC, MMWR, 2003, 52 www.cdc.gov

Criteri di laboratorio per definire l’infezione da SARS-CoV Diagnosi di SARS confermata Isolamento in coltura di SARS-CoV Identificazione del genoma di SARS-CoV mediante test molecolare di RT-PCR (validato da OMS e CDC) Presenza di anticorpi anti-SARS-CoV nella fase acuta o dopo 21 giorni dall’esordio (test sierologici validati da OMS e CDC) Diagnosi di esclusione di SARS Diagnosi alternativa (altro agente patogeno) che spieghi il quadro clinico Assenza di anticorpi anti-SARS-CoV nel siero prelevato nella fase di convalescenza (>21 giorni dall’esordio) CDC, MMWR, 2003, 52 www.cdc.gov

Identificazione di SARS-CoV Materiali Biologici Diagnosi rapida Analisi molecolari Risultati in <1 giorno Isolamento in colture cellulari Effetto citopatico Vero E6 Giorni 3-5 Microscopia elettronica Virioni tipo Coronavirus Risultati in piu’ giorni Identificazione con pool di anticorpi policlonali per Coronavirus (35-40 antisieri) Drosten,et al. NEJM, 2003; 348, 20 Ksiazek et al. NEJM, 2003, 348:20

Polymerase Chain Reaction (PCR) DNA denaturation Primers annealing & extention Amplification Sequence to be amplified Taq n cicl.... Numero di cicli 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 30 Numero di molecole ottenute 16 32 64 128 256 512 1.024 1.048.576 1.073.741.724 Y= x2n Y= numero molecole di DNA amplificato x= numero molecole di DNA di partenza n= numero dei cicli di PCR Risultati in <1 giorno

Real time PCR 6 ore cycles Quantizzazione SARS-CoV Sensibilità 1-10 copie 6 ore

secondo validazione OMS e CDC Diagnosi rapida di SARS-CoV S.C. Microbiologia, ASO San Giovanni Battista - Molinette Real-Time RT-PCR secondo validazione OMS e CDC Estrazione RNA Retrotrascrizione RNA-cDNA Real time PCR multiplex controllo interno di competenza DNA 6 ore

Identificazione di SARS-CoV sensibilità clinica dei test Pazienti con campioni positivi/pazienti totali affetti da SARS RT-PCR Isolamento in coltura Sierologia 15/17* 5/17 7/17 *i due casi RT-PCR negativi (tamponi orofaringei) presentavano anticorpi specifici contro SARS-CoV Campioni: Lavaggio orofaringeo (n=13) Tampone nasale (n=5) Bal (n=1) Escreato (n=2) Aspirato midollare (n=1) Biopsia polmonare (n=2) Biopsia renale (n=1) Ksiazek et al. NEJM, 2003, 348:20

Analisi molecolare di SARS-CoV Criteri di validazione del test di PCR Test ripetutamente positivo (almeno 2 volte) sullo stesso campione Test positivo su due campioni differenti es. tampone nasofaringeo e feci/sangue Test positivo su due campioni provenienti dallo stesso sito ma raccolti a distanza di 1-2 giorni CDC, MMWR, 2003, 52 www.cdc.gov

Campioni biologici per i test di laboratorio in caso di sospetta SARS Materiali provenienti dalle vie respiratorie superiori Lavaggi/aspirati naso e orofaringei Tamponi naso-faringei e oro-faringei Escreato Materiali provenienti dalle vie respiratorie inferiori Lavaggio bronco-alveolare Broncoaspirato e aspirato tracheale Liquido pleurico Sangue Sangue intero Siero per dosaggio anticorpale Due prelievi : uno in fase acuta e uno nella fase di convalescenza (>21 giorni dall’esordio) CDC, MMWR, 2003, 52 www.cdc.gov

Carica virale di SARS-CoV nei diversi materiali: studio di un caso indice Materiale Giorno dall’esordio RT-PCR nested Real-time PCR Carica virale/ml Surnatante colture + 8.3x106 Escreato +9 +3 108 6x104 Tampone orofaringeo - <800 Tampone nasofaringeo Plasma 190 BAL +11 4x105 Feci +19 +25 ND Drosten,et al. NEJM, 2003, 348:20

Agenti di bioterrorismo Riconoscimento dell’eziologia di SARS Esclusione dei patogeni respiratori e di altri patogeni che possono interessare le basse vie respiratorie Agenti di bioterrorismo Yersinia Mycoplasma Chlamydia Legionella Coxiella burneti Rickettsiae Virus dell’influenza A e B Paramyxoviridae RSV e metapneumovirus Mastadenoviridae Herpetoviridae Hantavirus Picornaviridae Arenavirus Metodiche tradizionali Colture microbiologiche Colture cellulari Indagini sierologiche Inoculazione in topi Microscopia elettronica BSL 3 Metodiche molecolari Drosten,et al. NEJM, 2003; 348, 20, Ksiazek et al. NEJM, 2003, 348:20

Test sierologici per SARS-CoV caratteristiche e limiti SARS-CoV non ha mai circolato nell’uomo Anticorpi positivi a +10 giorni dall’infezione crescita lenta Un singolo test positivo e’ indicativo di infezione acuta/recente richiesto il dosaggio delle IgM e/o la valutazione dell’incremento (almeno 4 volte) del titolo anticorpale Un test negativo non esclude SARS Esclusione di SARS : assenza di anticorpi specifici in siero convalescente (>21 giorni dopo l’insorgenza della malattia) IFA disponibile commercialmente per Ab totali CDC, MMWR, 2003, 52 www.cdc.gov

SARS: aspetti organizzativi del Laboratorio BSL 3 per manipolazione dei campioni Personale specializzato e addestrato ad hoc biologi e tecnici molecolari Turni di pronta disponibilità specifica

Variabilità genetica di SARS-CoV Da dove viene SARS-CoV ? Ibrido da fenomeni di ricombinazione genetica che occorrono naturalmente 10% di fenomeni di ricombinazione genetica nello stesso virus animali coinfettati da due Coronavirus producono una progenie per il 50% costituita da ricombinanti colture cellulari : 102-103 ceppi ricombinanti ogni 5 milioni di cellule infettate o transfettate Salto di specie da animale a uomo Coronavirus animale che ha trovato nell’uomo un ambiente favorevole (assenza di immunita’) Di che animale si tratta??

Analisi molecolare delle varianti virali 1-Analisi delle sequenze nucleotidiche Confronto sequenze nucleotidiche e aminoacidiche dei diversi gruppi di Coronavirus similitudine di SARS-CoV: 0.56-0.63 (nt) e 0.57-0.74 (aa) SARS-CoV e’ un Coronavirus diverso da quelli noti Albero filogenetico di SARS-CoV

2- Microarray & Microchips Analisi molecolare delle varianti virali 2- Microarray & Microchips Due tipi di disegno : sonde specifiche per ogni possibile variante di un gene es.gene POL per mutazioni di RT di HIV sonde specifiche per ogni singola variante virale es. sonde specifiche per i diversi Coronavirus Enormi potenzialità nell’identificare nuovi agenti patogeni (Bioterrorismo) e nuove varianti virali farmacoresistenti (HIV e Micobatteri) Costi molto elevati.....

Scenario Individuo suscettibile Biologia Molecolare RNA/DNA Migliore comprensione della biologia virale Individuo suscettibile Migliori strategie per la diagnosi e il controllo delle infezioni virali Tecniche di manipolazione genetica Nuovi vaccini Salto di specie? HIV 1 e 2 Il virus Hendra Il virus Nipah Il virus dell’influenza A H5N1 SARS-CoV? Bioterrorismo? Biologia Molecolare