TEST PER LA VALUTAZIONE DEI FARMACI D’ABUSO

I test che valutano le potenzialità d’abuso di un farmaco, vengono svolti: 1) Su nuovi composti per studiare se posseggono eventuali proprietà d’abuso. Sarebbe auspicabile che un farmaco ad attività analgesica non possegga la capacità di dare abuso e dipendenza. 2) Su composti già noti per studiare i meccanismi che stanno alla base della tossicodipendenza e per ricercare nuovi farmaci che possano contrastare quest’ultima

LE SOSTANZE D’ABUSO E LA TOSSICODIPENDENZA La tossicodipendenza è riconosciuta come patologia a tutti gli effetti. Si manifesta nei confronti di particolari sostanze, chiamate farmaci d’abuso, la cui assunzione porta alla percezione di sensazioni di immenso piacere e di euforia. L’individuo che ne è affetto manifesta un comportamento compulsivo di ricerca e di assunzione del farmaco d’abuso. Il desiderio diventa così insistente da dominare lo stile di vita della persona e da compromettere la qualità della vita stessa. I problemi di carattere familiare, lavorativo e sociale sono conseguenti.

L’individuo perde totalmente il controllo sulle quantità di sostanza che viene assunta e continua nel suo atteggiamento compulsivo nonostante conosca i danni fisici e le pene giudiziarie cui va incontro. Secondo il Manuale Statistico Diagnostico, una sostanza è in grado di dare origine ad abuso se in seguito al suo utilizzo si manifestano nell’arco di 12 mesi una o più delle seguenti condizioni: • Uso rincorrente e incapacità di svolgere una vita sociale, lavorativa e familiare • Uso rincorrente della sostanza in situazioni fisicamente rischiose • Ricorrenti problemi legali relativi all’uso della sostanza, ad esempio il compimento di atti illeciti • Uso continuativo della sostanza nonostante persistenti o ricorrenti problemi sociali o interpersonali

Secondo il Manuale Statistico Diagnostico, si può diagnosticare una tossicodipendenza se nell’arco di 12 mesi si manifestano almeno 3 delle seguenti condizioni: Tolleranza, intesa come quel fenomeno che si instaura in seguito ad un uso cronico della sostanza, tale per cui è necessario aumentarne progressivamente la dose per ottenere l'effetto originario • Astinenza, evidenziabile attraverso segni e sintomi caratteristici che si manifestano quando si riduce bruscamente o si annulla l’assunzione di una droga che induce dipendenza fisica • Assunzione frequente • Desiderio persistente o tentativi infruttuosi di ridurre o controllare l’uso della sostanza, tale per cui il desiderio di assumere la droga è molto più forte rispetto alla volontà di smettere

• Dispendio di una grande quantità di tempo in attività necessarie a procurarsi la sostanza, ad assumerla o a riprendersi dai suoi effetti. Il tossicodipendente ha come obiettivo principale quello di ricercare e di consumare la sostanza Questo ha come conseguenza: • Interruzione o riduzioni di importanti attività sociali, familiari, lavorative o ricreative a causa dell’uso della sostanza • Uso continuativo della sostanza nonostante la consapevolezza di avere un problema persistente o ricorrente, di natura fisica o psicologica, verosimilmente causato o esacerbato dalla sostanza

La capacità di certe sostanze di dar luogo al fenomeno della tossicodipendenza può essere valutata attraverso modelli sperimentali che analizzano: l’attività gratificante la dipendenza

Modelli sperimentali utilizzati possono valutare: Gli effetti gratificanti mediante: La Conditioned Place Preference L’autosomministrazione L’autostimolazione La quantificazione dei livelli di Dopamina nelle aree mesolimbiche (shell del Nucleus Accumbens) Il test della discriminazione

Dipendenza: Mediante la valutazione di una crisi d’astinenza che può essere indotta o insorgere spontaneamente

CONDITIONED PLACE PREFERENCE

L’animale viene posto in una gabbia costituita da due compartimenti che si differenziano fra loro per il colore delle pareti e che sono separati da un compartimento centrale. Un comparto ad esempio può avere le pareti bianche e l’altro a righe bianche e nere. L’animale viene lasciato libero di esplorare entrambi gli ambienti per un certo periodo di tempo, detto habituation. L’habituation dura un’ora e dopo questo periodo l’animale sceglierà un ambiente, cioè svilupperà una preferenza innata, valutabile in base alla quantità di tempo che passa in un comparto piuttosto che nell’altro. Dopo l’habituation segue un periodo di condizionamento che dura circa una settimana, durante il quale l’ambiente meno preferito verrà associato alla somministrazione del farmaco mentre quello preferito sarà associato alla somministrazione di soluzione fisiologica. Ad esempio se l’animale preferisce le righe il farmaco verrà somministrata nel compartimento bianco e viceversa.

Questo trattamento avviene a giorni alterni. Il primo giorno si somministra la sostanza d’abuso nel comparto meno preferito, il giorno successivo si somministra la fisiologica nel comparto preferito, e così via. Il giorno del test l’animale ha la possibilità di scegliere tra i due comparti. Se il farmaco è gratificante, la preferenza che l’animale mostra per un comparto viene invertita durante il condizionamento. Quindi se l’animale durante l’habituation aveva mostrato preferenza per il comparto a righe, il giorno del test preferisce il comparto bianco perchè ricorda la sensazione piacevole associata alla somministrazione della sostanza d’abuso. Il test si può effettuare anche nel caso di un farmaco che presenta effetti disforici. In questo caso l’animale continuerà a rimanere nel comparto cui è stata associata la salina.

Se il nostro farmaco ha spiccate potenzialità d’abuso, sono sufficienti anche 2 sole somministrazioni. In caso contrario l’animale andrà esposto più volte al farmaco. E’ possibile mandare l’animale in estinzione, ossia si continua il trattamento a giorni alterni, ma somministrando la soluzione fisiologica in entrambi i comparti. In questo modo non si perpetua più l’associazione tra stimolo e ambiente. Il giorno del test l’animale non mostrerà più preferenza per il comparto nel quale un tempo ha ricevuto la sostanza d’abuso, perché questa risposta è andata in estinzione. Se dopo l’estinzione si associa nuovamente la somministrazione della sostanza ad un comparto, l’animale libero di scegliere trai due comparti, sceglierà ancora una volta di stare in quello nel quale ha ricevuto il farmaco.

Place preference induced by morphine (0. 5, 1. 0, and 2. 0 mg/kg s. c Place preference induced by morphine (0.5, 1.0, and 2.0 mg/kg s.c.) or saline (s.c.) after one pairing to the individually unpreferred compartment. Each bar represents mean±SEM of the time spent (in seconds) in initially unpreferred compartment during a 15-min pretest (open bars) and a 15-min test session (closed bars). *P<0.001 vs saline (s.c.)

Una variante prevede l’utilizzo di una gabbia con i comparti entrambi a righe: in uno verticali e nell’altro orizzontali.

La presenza in entrambi i comparti delle strisce, orientate però in modo differente, rende gli ambienti diversi senza che però si sviluppi una preferenza innata per uno o per l’altro. Una gabbia di questo tipo viene utilizzata per mettere in luce eventuali proprietà avversive di una sostanza legate ad esempio alla capacità di quel farmaco di legarsi anche ai recettori K

SELF-ADMINISTRATION

Questo modello cerca di ripetere nel complesso ciò che avviene nell’essere umano che si approccia alla sostanza d’abuso, la trova, la consuma, apprende ad associare ai suoi effetti gratificanti gli stimoli neutri che fanno da corollario all’utilizzo del farmaco, mantiene la sua assunzione costante nel tempo, va in astinenza se per qualche motivo ne interrompe l’utilizzo, ricade nella sua somministrazione

FASI DELLA TOSSICODIPENDENZA Nella tossicodipendenza possiamo evidenziare 3 fasi: 1. acquisizione 2. mantenimento 3. Estinzione La fase di acquisizione è la fase in cui il tossicodipendente conosce la sostanza, quindi inizia ad avere un contatto con essa, conosce gli effetti gratificanti e gli effetti avversi, e inizia ad associare gli aspetti gratificanti a stimoli neutri che predicono la presentazione della sostanza.

Nella fase di mantenimento il tossicodipendente inizia a fare un uso costante della sostanza ed è la fase in cui si instaura il craving, ossia gli stimoli secondari assumono una valenza abnorme e il contatto con essi anche in assenza della sostanza è in grado di causare un desiderio spasmodico della stessa nell’individuo. 3. La fase di estinzione non è sempre presente. E’ associata alla sospensione del consumo, che in alcuni casi è volontario. E’ dunque il tossicodipendente che in maniera autonoma decide di seguire il protocollo di disintossicazione. Questa fase, se e quando inizia, potrebbe non durare a lungo, infatti nella maggior parte dei casi, in seguito all’esposizione di stimoli secondari, si ricade nella tossicodipendenza.

VIE DI AUTOSOMMINISTRAZIONE DI FARMACI GRATIFICANTI ENDOVENOSA INTRAGASTRICA ORALE INTRACEREBRALE

FASI DELLA AUTO-SOMMINISTRAZIONE PER OTTENERE LA AUTO-SOMMINISTRAZIONE DI FARMACI D’ABUSO SI UTILIZZANO GABBIE PARTICOLARI CHIAMATE SKINNER BOX :

L’ANIMALE IMPARA A COMPIERE UN LAVORO PER OTTENERE LA RICOMPENSA: PRESSIONE DI UNA LEVA= l’animale impara a premere una leva per ottenere la somministrazione del farmaco e a discriminare tra una leva attiva e una inattiva (la cui pressione non ha conseguenze). ATTIVITA’ DI NOSE POKING= l’animale impara ad inserire il muso in un foro (NOSE POKE) per ottenere la ricompensa e a discriminare tra un nose poke attivo e uno inattivo (la attività di nose poking non ha conseguenze). L’animale può anche imparare tra diverse leve o NP la cui attivazione fornisce l’erogazione di dosi diverse di farmaco.

leve

Nose pokes

PER FACILITARE IL LAVORO VENGONO UTILIZZATI UNA SERIE DI STIMOLI QUALI LUCI E SUONI CHE PREDICONO L’EROGAZIONE DEL FARMACO E DIVENTANO QUINDI STIMOLI CONDIZIONATI SI ATTUA IN QUESTO MODO UN CONDIZIONAMENTO DI TIPO OPERANTE

CONDIZIONAMENTO CLASSICO O PAVLOVIANO: ASSOCIAZIONE TRA STIMOLO NEUTRO E STIMOLO PRIMARIO. LO STIMOLO NEUTRO DIVENTA CONDIZIONATO ALLO S PRIMARIO E QUINDI SECONDARIO AD ESSO. ESEMPIO DEL CANE DI PAVLOV CONDIZIONAMENTO DI TIPO OPERANTE: ASSOCIAZIONE TRA STIMOLO/I NEUTRI CHE PREDICONO LA POSSIBILITA’ DI COMPIERE UN LAVORO PER OTTENERE UNA RICOMPENSA

FASI DELL’AUTO-SOMMINISTRAZIONE: SESSIONE= PERIODO TOTALE DURANTE IL QUALE SI ALTERNANO LE VARIE FASI DELL’AUTOSOMMINISTRAZIONE. LA SUA DURATA VARIA DAI 30 MIN AD ALCUNE ORE SI DIVIDE IN FASI. NEL PIU’ SEMPLICE DEI CASI: FASE “READY STATE”: si accende la house light FASE S1: accensione di luci e/o suoni. L’animale può lavorare per ottenere la ricompensa FASE S2: erogazione della ricompensa FASE S3: time out o periodo di pausa in cui tutto si spegne e anche se l’animale “lavora” non ottiene alcuna ricompensa Ogni fase ha una sua specifica durata che varia a seconda del protocollo (schedula) utilizzato

Schedule a Rapporto fisso (RF): ricompensa dopo un numero fisso di risposte Schedule ad Intervallo fisso (IF): ricompensa dopo un certo numero di risposte ma dopo un intervallo fisso di tempo Schedule ad Intervallo Variabile (VF): ricompensa dopo un certo numero di risposte ma dopo un intervallo variabile di tempo Schedule con Time Out Variabile (VF): ricompensa dopo un certo numero di risposte ma l’inizio della nuova sessione avviene con un tempo variabile Schedule Random Ratio (RR): la ricompensa viene fornita secondo una probabilità che viene decisa dall’operatore e che viene chiamata p= ricompensa / risposta. Generalmente però più un modello è semplice, più è gestibile e da dei risultati più affidabili.

VARIABILI CHE INFLUENZANO L’AUTOSOMMINISTRAZIONE DI FARMACI GRATIFICANTI COMPORTAMENTALI (programma di auto-somministrazione) FARMACO (dose, via di somministrazione, somministrazioni precedenti)

COCAINE SELF-ADMINISTRATION Lecca et al., 2007

ETHANOL SELF-ADMINISTRATION -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 -25 25 50 75 100 125 150 175 200 Nose Pokes NAc SHELL N=5 FR 1 NOSE POKES INATTIVI NOSE POKES ATTIVI Tempo (giorni) NAc CORE ETHANOL SELF-ADMINISTRATION -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 time (days) EtOH intake (g/Kgl) NAc SHELL FR1 self administered intake passive training exp NAc CORE FR1 Nose Pokes durante il training Protocollo FR1 CON Time Out fisso Bassareo et al., in preparazione

SUCROSE PELLETS SELF-ADMINISTRATION -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 -50 50 100 150 200 250 time (days) INACTIVE NOSE POKE NOSE POKES NAc SHELL ACTIVE NOSE POKES FR 1 NAc CORE PFCX INACTIVE NOSE POKES SUCROSE PELLETS SELF-ADMINISTRATION Nose Pokes durante il training Protocollo FR1 CON Time Out fisso Bassareo et al., 2015

SUCROSE PELLETS SELF-ADMINISTRATION -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 -100 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 time (days) INACTIVE NOSE POKES NOSE POKES NAc SHELL ACTIVE NOSE POKES FR 1 FR 5 FR 3 NAc CORE PFCX SUCROSE PELLETS SELF-ADMINISTRATION Nose Pokes durante il training Protocollo FR5 con Time Out variabile Bassareo et al., in preparazione

Se la sostanza è veramente gratificante l’animale continuerà a fare tutti i nose pokes richiesti per ricevere una sola dose. La risposta dell’animale è infatti in relazione alle proprietà gratificanti della sostanza: l’animale valuterà il rapporto sforzo/gratificazione. Si arriverà poi a un punto, detto breaking point, in cui l’animale smetterà di lavorare, ossia capirà che il lavoro necessario per ricevere la dose non rispecchia la gratificazione data dalla dose stessa. La cocaina è un farmaco d’abuso che possiede un breaking point molto alto, mentre al contrario la nicotina presenta un breaking point molto basso.

● Modelli di estinzione L’animale che ha acquisito una determinata risposta operante, e che quindi impara a compiere un lavoro per ottenere una ricompensa, può essere sottoposto ad un protocollo di estinzione in seguito al quale non lavora più per ottenere la ricompensa. L’animale viene posto nella gabbia per la auto-somministrazione ma non viene presentato alcuno stimolo predittivo. Inizialmente l’animale lavorerà per ottenere la sua ricompensa che però non arriva. Il primo giorno l’attività di pressione della leva attiva o di nose poking sarà notevolmente aumentata, perchè l’animale cerca inutilmente di ricevere la dose compiendo il lavoro che prima era sufficiente per ricevere la sostanza d’abuso. I giorni seguenti l’animale capirà di non avere più a disposizione la sostanza e smetterà di lavorare. Si dice che l’animale è andato “in estinzione”, cioè ha estinto il comportamento operante.

In seguito all’estinzione del comportamento operante è possibile valutare la ricaduta attraverso la ripresentazione degli stimoli condizionati ma non la somministrazione del farmaco d’abuso. Nonostante prema la leva o esegua i nose pokes e non riceva la sostanza, si riesce a ristabilire il modello operante. Si può ottenere la ricaduta nella auto-somministrazione della sostanza anche attraverso modelli sperimentali in cui l’operatore somministra all’animale delle piccole dosi del farmaco di cui prima abusava e questo rinduce nell’animale il comportamento operante. Nel caso di farmaci narcotici e psicostimolanti, l’animale in seguito all’estinzione, si auto-somministra la sostanza in una dose pari a quella che era abituato ad assumere durante il condizionamento.

self administration di tipo pavloviano (non operante) Nel comportamento non operante la via di auto-somministrazione orale è quella più comunemente utilizzata Si utilizza per esempio per valutare le proprietà d’abuso dell’alcol. L’animale non deve compiere alcun lavoro per bere l’alcol. Può scegliere tra due bottiglie: una contenente acqua, l’altra contenente una soluzione alcolica. Bisogna valutare bene la concentrazione di alcol utilizzata, in quanto concentrazioni troppo basse non inducono alcun effetto, mentre troppo alte provocano effetti disforici. Si scelgono concentrazioni comprese tra il 8% e il 12%. L’animale viene abituato a bere dosi crescenti di alcol, si parte da una soluzione al 4% e man mano che l’animale acquisisce tale comportamento si arriva sino al 20%.

AUTOSTIMOLAZIONE INTRACRANICA

Impianto chirurgico di un elettrodo per la stimolazione elettrica, nel VTA o nell’accumbens (shell). L’animale viene sottoposto ad un training simile a quello visto per la self-administration. Si utilizza lo stesso tipo di gabbia. Si possono scegliere diversi protocolli sperimentali. L’animale impara a premere una leva o a fare nose poking per ottenere una stimolazione elettrica attraverso l’elettrodo posizionato in una delle aree che fanno parte dei circuiti della gratificazione. La stimolazione ha un’intensità intorno ai 55 µA

RISPOSTE DELLA DOPAMINA MESOLIMBICA ALLE SOSTANZE D’ABUSO E AL CIBO

Tutti i farmaci d’abuso possiedono la proprietà di far aumentare il rilascio di DA in modo preferenziale nella SHELL del NUCLEO ACCUMBENS

shell after i.v. cocaine Preferential increase of DA in the NAc Pontieri, Tanda, Orzi & Di Chiara, PNAS,1995

Selective increase of DA in the NAc shell after i.v.THC and heroin Tanda, Pontieri & Di Chiara, Science, 1997

Selective increase of DA in the NAc shell after i.v. nicotine

(proseguimento dell’amigdala estesa) e il nucleo accumbens. Nell’uomo le strutture attivate dalla somministrazione di sostanze d’abuso sono simili a quelle osservate nel ratto. L’attivazione dell’amigdala estesa che comprende i vari nuclei dell’amigdala, il bed nucleus della stria terminale (proseguimento dell’amigdala estesa) e il nucleo accumbens.

Ma cosa succede alla DA nella shell dopo il consumo di un cibo appetitoso? FONZIES CHOCOLATE SYRUP DRUG

CIBO APPETIBILE E SAPORITO

QUANTO TEMPO PERMANE L’HABITUATION? (Bassareo e Di Chiara, 1997)

EFFETTO DELLA SOMMINISTRAZIONE DI SOLUZIONI CONTENENTI IL 10% DI ETANOLO SULLA DA NELLA SHELL

FARMACI D’ABUSO E CIBO HANNO IN COMUNE LA PROPRIETA’ DI STIMOLARE LA TRASMISSIONE DOPAMINERGICA (DA) NEL NUCLEO ACCUMBENS

DIFFERENZE: CIBO FARMACI DOPO RIPETUTI CONSUMI DI CIBO LA TRASMISSIONE DOPAMINERGICA NELLA SHELL VA INCONTRO ALL’HABITUATION FARMACI DOPO RIPETUTE SOMMINISTRAZIONI DI FARMACI LA TRASMISSIONE DOPAMINERGICA NELLA SHELL CONTINUA AD ESSERE STIMOLATA

Abnorme apprendimento associativo Mancanza di habituation della stimolazione della DA nella SHELL da parte dei farmaci Abnorme apprendimento associativo Eccessiva facilitazione dell’acquisizione di proprietà incentive di stimoli condizionati (Di Chiara, 1998)

NEL TOSSICODIPENDENTE GLI STIMOLI SECONDARI ASSOCIATI AL FARMACO D’ABUSO ASSUMONO UN RUOLO DETERMINANTE NEL MANTENIMENTO DELLA TOSSICODIPENDENZA

L’attivazione di particolari aree cerebrali coinvolte nella tossicodipendenza attraverso la risonanza magnetica nucleare A sin presentazione di uno stimolo neutro per l’individuo= un video sulla natura A dx presentazione di uno stimolo condizionato alla cocaina= un video che riporta dei tossicodipendenti nell’atto di autosomministrarsi la cocaina

TEST DI DISCRIMINAZIONE

Test discriminazione Addestramento Esperimento Veicolo - leva A H2O / cibo Farmaco A - leva B H2O / cibo Esperimento Farmaco B - leva B H2O / cibo Farmaco C - leva A H2O / cibo Farmaco B = farmaco A Farmaco C diverso da farmaco B

TEST DI VALUTAZIONE DELL’ATTIVITA’ MOTORIA

Lo studio dell’attività motoria viene fatto per valutare in acuto l’attivazione motoria legata ai farmaci d’abuso. Tale studio viene applicato ogni qualvolta si voglia studiare un affetto di attivazione o riduzione dell’attività motoria associata ad un farmaco. L’animale viene messo in una gabbia particolare dotata lateralmente di cellule fotoelettriche che registrano gli spostamenti dell’animale. Quando si valuta in acuto l’effetto del farmaco, si somministra tale farmaco, ad esempio la cocaina, e si mette l’animale nella gabbia e lo si lascia per un tempo variabile, che dipende dalle caratteristiche del farmaco in studio, e si misura l’attività dell’animale. Prima di tutto questo è necessario che l’animale subisca un periodo di ambientamento. In questo periodo di ambientamento verranno misurati i movimenti dell’animale e verranno considerati come movimenti base (come normale attività motoria dell’animale).

Il giorno del test, viene somministrato il farmaco all’animale e si pone nella gabbia. Tutte le modificazioni rispetto al comportamento basale saranno considerate come l’effetto del farmaco. E’ possibile valutare l’effetto del farmaco sull’attività motoria anche in cronico, effettuando delle somministrazioni ripetute. Ad esempio la cocaina è un farmaco che da sensitizzazione, e somministrazioni ripetute potenziano l’attività motoria.

Dipendenza

La dipendenza creata dall’utilizzo cronico di un farmaco può essere valutata mediante la precipitazine di una crisi di astinenza. Questa può essere indotta dalla somministrazione di un composto antagonista, che spiazza il nostro agonista di cui vogliamo valutare l’eventuale capacità di dare dipendenza, dai suoi siti recettoriali. Dalla mancata somministrazione del nostro farmaco agonista dopo un periodo di sommiistrazione cronica Se una crisi di astinenza sopraggiunge si manifesteranno tutta una serie di sintomi che possono essere classificabili e quantificabili.

SINDROME D’ASTINENZA lacrimazione rinorrea sbadiglio sudorazione midriasi anoressia irrequietezza irritabilità tremore spasmi intestinali Diarrea brividi arrossamento cute orripilazione crampi addominali dolori ossa e muscoli 8-12 ore 48-72 ore mancata assunzione di cibo; vomito, sudorazione e diarrea causano disidratazione; chetosi, perturbazione equilibrio acido-base 7-10 giorni

Withdrawal abstinence signs associated with morphine-like dependence in rat Autonomic Hypotermia Ptosis Lacrimation Rhinorrea Urination Diarrhea Penile erection and emission Psychomotor Rearing Jumping writhing Rubbing (face) Teeth chattering Wet-dog shakes Decreased seizure threshold Behavioural Sequealing hostility when handled Exaggerated startle reaction Decreased eating and drinking Loss of body weight