Trombocitemia Essenziale Dr.ssa Elena Elli Ematologia Monza 28/04/2015

Definizione e epidemiologia La Trombocitemia Essenziale (ET) è una malattia clonale della cellula staminale emopoietica caratterizzata da una proliferazione persistente ed incontrollata della linea piastrinopoietica, cioè la linea midollare che produce le PLT. In Europa l'incidenza della ET è di circa 0,3-1 caso ogni 100.000 abitanti per anno. Negli Stati Uniti è circa il doppio. L’'età mediana alla diagnosi è 54 anni ed il 43% dei pazienti ha meno di 50 anni. La malattia è più frequente nel sesso femminile con un rapporto maschi/femmine di 1 a 2. Nessun agente eziologico esterno è stato individuato. La storia naturale della malattia è caratterizzata da un progressivo aumento delle PLT la cui conseguenza é un aumentato rischio di complicanze trombotiche o emorragiche. E' possibile, anche se infrequente, l'evoluzione tardiva in mielofibrosi o in una leucemia acuta.

Patogenesi e clonalità: ruolo TPO La Trombopoietina (TPO) è considerata il più importante regolatore della magacariopoiesi e della produzione piastrinica. La sua azione stimolante avviene sia a livello della cellula staminale/MK che delle PLT. Queste ultime infatti posseggono il recettore di TPO (c-mpl). In condizioni normali la concentrazione plasmatica di TPO è inversamente proporzionale al numero di PLT ed alla massa megacariocitaria: ciò consente alle piastrine di mantenersi entro valori normali in tutte le condizioni.

Patogenesi e clonalità: TPO I pazienti con piastrinosi da ET hanno valori di TPO normali o moderatamente aumentati. Tale eccesso di TPO sembra maggiormente correlato ad un difetto della regolazione/attivazione del suo recettore piastrinico, c-Mpl più che ad una iperproduzione autonoma di TPO, che si traduce in un aumento TPO free A dispetto bassi livelli c-mlp, i MK sono ipersensibili a TPO

Novità nella patogenesi Mutazione JAK2V617F Mutazioni gene mpl Mutazioni gene calreticolina

JAK2 (V617F) nella TROMBOCITEMIA ESSENZIALE La mutazione è presente nel 23-57% (in media 40-50%) dei casi di ET; per lo più in forma eterozigote La mutazione è assente nei casi di trombocitosi secondaria e nei controlli sani I pazienti JAK2 negativi tendono a rimanere tali e quelli positivi tendono ad avere un basso burden allelico, stabile. Si nota infatti unicamente un incrementare della produzione di alleli mutati quando si ha una evoluzione in MMM secondaria Cazzola, Haematologica 2006

JAK2 (V617F) nella TROMBOCITEMIA ESSENZIALE Esistono ET JAK2 positive e negative ET JAK2 positive Età più avanzata Valori più elevati di Hb, GB (PMN) e minor conta PLT alla diagnosi Concentrazioni seriche più basse di EPO e ferritina Maggior cellularità midollare con iperplasia eritroide e granulopoietica Alta frequenza di EEC e PRV-1 overexpression Maggior tendenza a sviluppare trombosi venose Maggior rischio di evoluzione in PV Nel gruppo trattato con HU  minor dosi di farmaco x controllo malattia ET JAK2 negative Spesso piastrinosi isolata Iperplasia prevalentemente megacariocitica a livello midollare Alte anomalie citogenetiche Campbell, Lancet 2005 – Antonioli, Leukemia 2005 – Cheung, BJH 2005

ET JAK2 positive e negative: 2 entità diverse o un continuum? 2 modelli: JAK2 mutazione è necessaria ma non sufficiente per sviluppare un fenotipo MPD, essa cioè si verificherebbe in un subclone con una precedente non nota mutazione. Secondo tale modello la prima mutazione citogenetica è responsabile delle ET Jak2 negative, le quali successivamente possono evolvere in ET Jak2 positive con l’acquisizione della Jak2 mutazione. ET Jak2 positive e negative siano due malattie diverse. Cazzola, Gain of function, loss of control – A molecular basis for chronic yeloproliferative disorders - Haematologica 2005

Acquired 515 mutations in c-Mpl ET JAK2 NEGATIVE? Acquired 515 mutations in c-Mpl Sequence analysis of EPOR, TPOR and GCSFR in JAK2-negative PV, ET and MF led to the discovery of a somatic tryptophan to leucine substitution mutation at the transmembrane-juxtamembrane junction of MPL (MPLW515L). The MPLW515L allele occurs in approximately 10% of pts with JAK2V617F-negative MF, and in a smaller proportion of pts with ET. A smaller number of pts have an alternate mutation at codon 515, which results in a tryptophan to lysine substitution (MPLW515K). This allele is not observed in PV or other myeloid malignancies, suggesting that activation of JAK-STAT signaling by MPLW515L is specific to ET and MF. Expression of MPLW515L, but not wild-type MPL, results in factor-independent growth and constitutive activation of downstream signaling proteins including the STAT3, MAP kinase, and PI3K signal transduction pathways.

Acquired 515 mutations in c-Mpl Abnormalities within a 5-amino acid amphipathic motif which is a juxtamembranal domain of the c-Mpl receptor, leads to constitutive activation. This area, which extends from 514 to 518, is thought to prevent the 2 strands of the c-Mpl dimer from approximating when ligand is not bound to the receptor 2 acquired mutations have now been found at position 515 within this motif: W515L W515K Si ritrova in 5-10% ET JAK2 negative

Mutazione calreticolina nella TROMBOCITEMIA ESSENZIALE Giovane età Sesso maschile Alte PLT Bassa Hb Bassi WBC Minor rischio trombotico Miglior sopravvivenza Tefferi, Leukemia 2014

SEGNI E SINTOMI (1) La diagnosi di ET è spesso occasionale, cioè sospettata sulla base di un elevato valore di PLT evidenziato da un esame emocromocitometrico, che documenta solitamente un aumento delle PLT superiore a 600.000/µL con normali valori di Hb, ematocrito e leucociti Il 20% dei pazienti presenta un modesto ingrandimento della milza e del fegato. Il 35% riferisce sintomi vasomotori, come cefalea, vertigini, ronzii, parestesie periferiche, disturbi della vista, livedo reticularis e fenomeni Raynaud-simili. L'eritromelalgia che si presenta con un senso di bruciore alle mani ed ai piedi accompagnato da arrossamento e calore è un riscontro non raro. Rari sintomi sistemici, come febbre, artralgie, sudorazioni, dimagramento, dolori ossei, che sono invece frequenti in altre SMPc quali MFI o LMC. Il prurito al contatto con acqua è raro.

SEGNI E SINTOMI (2) Problemi trombotici o emorragici rappresentano le cause più frequenti di mortalità e morbilità e sono presenti all'esordio rispettivamente nel 15-20% e nel 25-30% dei pazienti. Le trombosi sono per lo più arteriose (infarto del miocardio, angina pectoris, ictus cerebrale, TIA o arteriopatie periferiche), quelle venose sono circa il 25% (trombosi venose profonde o tromboflebiti superficiali). Le manifestazioni emorragiche (epistassi, gengivorragia o emorragie del tratto gastroenterico) accompagnano spesso le piastrinosi di grado elevato (PLT superiori a 1.000-1.500.000/µL)).

Falanga, ASH 2012

TROMBOCITOSI cause Primitive Secondarie - da aumentata produzione - da alterata distribuzione da  PLT Risposta a farmaci

Trombocitemia ereditaria (alterazione R-TPO)

Malattia clonale Vs Cause reattive Clonal hematopoiesis/ Yes No Abnormal Cytogenetics Increased acute phase reactans No Yes Iron Deficiency No Possible

Esami di laboratorio e II livello Emocromo con formula  piastrinosi, a volte leucocitosi Profilo marziale e indici di flogosi Indici infiammatori Emostasi e Screening trombofilico (per valutazione completa rischio trombotico) Aspirato midollare (specie per differenziare MDS) BOM: consente di definire il tipo di proliferazione cellulare predominante, la cellularità midollare e di valutare l'eventuale presenza di fibrosi midollare Conta CD34+ (< 15 ) Ricerca mutazione JAK2V617F, mpl e calreticolina

TROMBOCITEMIA ESSENZIALE (ET) SANGUE PERIFERICO STRISCIO MIDOLLARE

Caratteristiche biopsia ossea in ET Cellularità normale Rapporto leuco-eritroblastico conservato Proliferazione predominante di megacariociti, aumentati in n°, allargati e giganti disposti a coppie o in clusters lassi MK con nucleo iperlobato, ipermaturo MK con citoplasma maturo senza alterazioni citologiche Assenza di alterazioni o segni di immaturità a carico granulopoiesi e eritropoiesi Assenza di significativo incremento della trama reticolinica

BIOPSIA OSTEOMIDOLLARE (BOM) CD61

Criteri diagnostici WHO 2001 WHO 2008 WHO 2014

Current WHO diagnostic criteria for ET (2001)

Distinzione ET vs MFI iniziale 24

OS diversa in ET vs MFI iniziale 25

Nuovi criteri ET WHO 2008 Tutti i criteri x diagnosi ET

RUOLO CENTRALE DELLA DIAGNOSI ISTOLOGICA NELLA CLASSIFICAZIONE WHO - REVISIONE PROPOSTA 2015 Criteri PV TE MF primaria Criteri maggiori 1.Hb >16,5 g/dL (uomini) o >16 g/dL (donne) o ematocrito >49% (uomini) o >48% (donne) 2. Ipercellularità midollare trilineare (panmielosi) riscontrata alla biopsia ossea con megacariociti pleomorfici 3.Presenza della mutazione JAK2V617F 1.Conta piastrinica maggiore di 450 x109/L 2.Proliferazione della linea megacariocitaria alla biopsia midollare, con aumento del numero di megacariociti ingranditi e maturi 3.Assenza di criteri WHO per LMC, PV, MF, MDS o altre neoplasie mieloidi 4.Presenza di mutazioni a carico di JAK2, CALR o MPL 1.Proliferazione della linea megacariocitaria e atipia associata alla presenza di fibrosi reticolinica o collagene 2.Assenza di criteri WHO per LMC, PV, TE, MDS o altre neoplasie mieloidi 3.Presenza di mutazioni a carico di JAK2, CALR o MPL Criteri minori 1. Valori di eritropoietina sierica inferiori al minimo dell’intervallo di riferimento 1.Presenza di un marker clonale (cariotipo alterato) o assenza di evidenza di trombocitosi reattiva 1.Presenza di marker clonale (cariotipo alterato) o assenza di evidenza di fibrosi midollare reattiva 2.Anemia o splenomegalia palpabile 3. Leucoeritroblastosi o aumento dei livelli sierici di LDH Tefferi A, et al. Leukemia. 2014; 28:1407-13

Decorso della malattia (1) Le principali complicanze cui un paziente può andare incontro sono di tipo trombotico (arterioso o venoso), o emorragico. I problemi trombotici, in particolare l'infarto del miocardio, e gli accidenti vascolari cerebrali rappresentano la causa più frequente di mortalità e morbilità nel decorso della ET. I fattori “convenzionalio” che predispongono ad un aumentato rischio di trombo-emorragico sono: un'età maggiore di 60 anni una storia di problemi trombotici o emorragici un'elevata conta piastrinica (PLT > 1.000.000 o 1.500.000/µL, a seconda degli autori). Il 45% circa dei pazienti definiti ad alto rischio vascolare, cioè con almeno uno dei fattori sopraelencati, va incontro a problemi trombotici seri in assenza di trattamento citoriduttivo. Il rischio emorragico è legato alla conta piastrinica molto elevata ma è soprattutto secondario ad una alterazione qualitativa della funzionalità piastrinica.

Decorso della malattia (2) La trasformazione della ET in altre malattie ematologiche come la leucemia acuta o la MFI è un evento infrequente e per lo più tardivo L’evoluzione in MFI non è frequente (5-10%), può svilupparsi tardivamente nel corso della ET: l'intervallo tra le due malattie supera in genere i 20 anni. Si manifesta con la comparsa di una sintomatologia sistemica (che è rara nella ET) e con una progressiva citopenia trilineare (riduzione di leucociti, Hb e PLT) associata ad un incremento della splenomegalia. L’evoluzione in leucemia acuta è ancor più rara nella ET (1-2%), specie rispetto alle altre SMPc. Deve essere sospettata quando si assiste ad un sensibile aumento o riduzione dei globuli bianchi, o riduzione di PLT ed Hb con febbre o manifestazioni emorragiche. Queste leucemie sono caratterizzate nella maggior parte dei casi da tipiche alterazioni del cariotipo, quali delezioni parziali o totali dei cromosomi 5 e/o 7 e 17.

Fattori influenzanti il rischio trombotico

PATOGENESI delle TROMBOSI MULTIFATTORIALE Anomalie delle cellule del sangue derivanti dalla proliferazione clonale delle HSC: Quantitative leucocitosi, eritrocitosi, piastrinosi Qualitative (acquisizione di un fenotipo coagulante) espressione di superficie di molecole pro-coagulanti secrezione di enzimi proteolitici secrezione di citochine infiammatorie Alterazioni secondarie a stato infiammatorio con attivazione cellulare e anomalie a carico delle normali cellule vascolari (disfx endotelio) Fattori clinici (età, sesso, pregressa trombosi, fdr vascolari, trombofilia) paziente correlati Falanga,ASH 2012

FATTORI CLINICI PAZIENTE CORRELATI Casini A et al. Thrombotic complications of myeloproliferative neoplasms: risk assessment and risk-guided management. JTH 2013.

Fattori clinici: ETA’ e pregressa TROMBOSI

Mutazione JAK2V617F Ruolo mutazione JAK2V617F nelle complicanze trombotiche in MPN conflittuale 2 metanalisi: Ziakas (Haematologica 2008): 2905 pazienti con ET (17 studi – 778 trombosi): la mutazione JAk2V617F si associa ad un rischio 2 volte superiore (OR 1.84) di sviluppare trombosi sia venose (OR 2.09) che arteriose (OR 1.96) nel fw-up così come alla presentazione (OR 1.88) Lussana (Thromb Res 2009): 3150 pazienti con ET (21 studi) la mutazione JAk2V617F si associa ad un rischio 2 volte superiore (OR 1.92) di sviluppare trombosi sia venose che arteriose (OR 2.49 e 1.77 rispettivamente)

Omozigosi per JAk2V617F e trombosi: dimostrato in ET (non in PV) HR omo: 3.97 HR etero: 1.49 HR WT: 1 Blood 2007

Burden allelico di JAk2 e ricorrenza trombotica Burden allelico JAk2 sembra associarsi con una incrementato rischio di ricorrenza di trombosi sia venose che arteriose 143 ET con storia trombosi: Pz OMO vs WT: HR 6.15 Pz ETERO: HR =WT (De Stefano, Ann Hematol 2010)

Perché JAk2V617F aumenta rischio trombotico? Attivazione PLT modulata dalla mutazione i JAk2: essa induce una overespressione di p-selectina che a sua volta induce reclutamento e attivazione di GB e promuove la formazione di complessi PLT/GB Poiché G-CSF R è correlato al JAk2 pathway, è possibile che la costitutiva attivazione del signaling attraverso questo R, indotta dalla mutazione JAk2V617F, possa in parte essere responsabile del fenotipo attivato dei neutrofili Falanga A et al. ASH 2012 – Cervantes F. et al.Haematoloica 2009 – Arellano-Rodrigo E. et al. Haematologica 2006

Score di rischio trombotico CONVENZIONALE Età (> 60 aa) Storia di trombosi PLT > 1000.000/mm3 (> 1500.000/mm3) IPSET Età Fdr vascolari Mutazione JAK2V617F Storia di trombosi 38

IPSET-Thrombosis: a new score to predict thrombosis in ET 891 patients, followed for 6.2 years Annual rate of thrombosis: 1.9% Factors TFS a 10y LR: 90% IR: 80% HR: 68% Risk of thrombosis Classi di rischio Punteggio Rischio trombotico Eventi x 100 pz/aa Basso 0-1 1.03 Intermedio 2 2.35 Alto >=3 3.56 This model better predicts thrombosis than conventional one: 0.95% p/y (LR), 2.86% p/y (HR) Barbui et al. Blood 2012 Dec 20;120(26):5128-33 39

Altri meccanismi alla base rischio trombo-emorragico Leucocitosi e Attivazione leucocitaria, che sembra indurre: Attivazione endoteliale ( vWAg) Attivazione coagulazione ( DD) Attivazione PLT ( P-selectina, CD11b e CD62P) Incrementata formazione aggregati PLT-PMN Von Willebrand acquisito (consumo dei multimeri a elevato PM con conseguente aumento rischio emorragico) nei casi di estrema trombocitosi Anomalie funzionali delle PLT e piastrine immature

ANOMALIE QUALITATIVE dei LEUCOCITI Role of polymorphonuclear leukocytes (PMN) in hemostasis f-MLP Cytokines Bacterial endotoxins C5a Cathepsin G Elastase Cathepsin G Reactive Elastase Reactive Oxygen Species Oxygen Species Blood coagulation Activation of Platelets Activation of Platelets Proteolysis and inactivation of natural inhibitors: - Protein C Endothelial Cells Endothelial Cells - Protein S - detachment, lysis - TFPI - prevent thrombin-induced prostacyclin - Antithrombin - induction of PAI-1 expression - Heparin cofactor II - Proteolysis of heparan sulphated proteoglycans - Proteolysis of thrombomodulin

ANOMALIE QUANTITATIVE dei LEUCOCITI: LEUCOCITOSI (alla diagnosi) Leukocytosis and thrombosis in ET (n 657) The cumulative probability to develop thrombosis in LR patients with high WBC count was similar to that of HR patients The value of WBC count with highest specificity and sensitivity was 9.4 x109/L

ANOMALIE QUANTITATIVE dei LEUCOCITI: LEUCOCITOSI (nel follow-up)

ANOMALIE QUALITATIVE DELLE PIASTRINE Incremento delle piastrine reticolate (immature circolanti) Importanza non tanto della conta piastrinica “assoluta” ma conta piastrine reticolate circolanti Correlazione con JAk2V617F positività Harrison P. Platelets 1997– Panova-Noeva M et al. Blood 2011– Panova-Noeva M et al. AJH 2011 - Barbui T et al. Blood 2013

Trattamento della trombocitemia essenziale Principi di base La terapia è mirata alla riduzione della conta piastrinica (PLT < 400.000/mm3) ma soprattutto alla riduzione del rischio trombotico e alla gestione delle complicanze trombo-emorragiche Occorre identificare i pazienti che necessitano di una terapia citoriduttiva in aggiunta alla terapia anti-aggregante 46

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Anti-aggregante L'impiego di farmaci antiaggreganti, quale l'aspirina a basse dosi (100 mg a giorni alterni), è consigliato, anche alla luce dei risultati dello studio ECLAP nella PV, in tutti i pazienti con ET, in particolare mandatorio in quelli con sintomi del microcircolo E^ controindicato nei pazienti con precedenti manifestazioni emorragiche o con patologie gastrointestinali potenzialmente emorragiche (gastrite ulcerosa) e nei pazienti con elevata piastrinosi (PLT>1.500.000/µL). In tal caso l’antiaggegante andrà introdotto dopo adeguata terapia citoriduttiva, quando la conta piastrinica sarà ridotta al di sotto di 1.000.000/µL.

Chi trattare con agenti citoriduttori?: Score di rischio trombotico CONVENZIONALE Età (> 60 aa) e/o Storia di trombosi e/o PLT > 1000.000/mm3 (> 1500.000/mm3) IPSET Età Fdr vascolari Mutazione JAK2V617F Storia di trombosi (>=2 fattori) IL PAZIENTE AD ALTO RISCHIO NECESSITA TRATTAMENTO CITORIDUTTIVO 49

TE – LINEE GUIDA CITORIDUTTORI RACCOMANDATI (HU: idrossiurea – ANA: anagrelide – INF: interferone) < 40 ANNI (escluse donne fertili) 40 – 60 anni 60 – 70 anni 1a Linea: IFN o ANA* >>> IFN CON precedente trombosi maggiore: 1a linea: HU (grado A) 2a linea: IFN o ANA >>>IFN o IFN+ANA o HU+ANA 1a Linea°: HU (grado A) 2a Linea: HU** >>> ANA* >>> ANA*+ IFN o ANA*+ HU** SENZA precedente trombosi maggiore: 1a linea: IFN o ANA (grado D) >>> IFN 2a linea: HU >>> ANA o IFN+ANA o HU+ANA BUS o PIPO (gr D) >>> HU+ANA o ANA o BUS o PIPO >70 anni * Registo o trial ** non escluso potenziale leucemogeno ° se in IFN o ANA da prima , continua tp in corso

TE – LINEE GUIDA GRAVIDANZA Citoriduzione con IFN (grado D) se almeno uno di: Precedenti trombosi o emorragia maggiori PLT > 1000 x109/L Trombofilia familiare o Fattori di rischio cardiovascolare Antipiastrinici se: Sintomi del microcircolo o precedenti aborti (grado D) Eparina LMW profilassi nel 3° trimestre con passaggio a TAO (INR 2-3) per 6 sett. nel puerperio (grado D) se: Trombosi pre-gravidanza Eparina LMW terapia e TAO nel puerperio (grado D) se: Trombosi durante gravidanza