LA VARIABILITA’ GENETICA DELLA POPOLAZIONE BOVINA SICILIANA: ANALISI DI UN PANNELLO STANDARDIZZATO DI MICROSATELLITI Vitale F., Reale S., Lupo T., Cosenza M., Migliazzo A.., Bivona M., De Maria C., Caracappa S. Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia INTRODUZIONE - L'obiettivo finale dell'indagine di genotracciabilità animale è la garanzia del consumatore attraverso l'assicurazione di qualità. Le metodologie applicate sono capaci di assicurare la tracciabilità delle carni lungo le filiere produttive e il controllo dei corretti campionamenti animali negli allevamenti. Già da tempo, studi di genetica di base mirati ai loci polimorfici sono stati sviluppati per chiarire le basi molecolari della diversità dei soggetti allevati. Come conseguenza della stretta integrazione dei bovini nella catena alimentare umana, le analisi forensi riguardanti il settore, rappresentano uno strumento di garanzia fondamentale. Attualmente gli studi di popolazione sono eseguiti attraverso l'applicazione di protocolli standardizzati che impiegano 11 loci polimorfici definiti STRs. Tali loci sono: BM2113, ETH3, ETH10, ETH225, BM1824, INRA023, SPS115, TGLA53, TGLA122, TGLA126 e TGLA227. Le sequenze analizzate sono quelle raccomandate dall'International Society for Animal Genetics (ISAG) per la definizione di uno standard necessario alla tipizzazione bovina attraverso le STRs. La tecnica prevede essenzialmente l'uso di una PCR multiplex seguita da una elettroforesi capillare. La capacità discriminativa degli alleli viene studiata attraverso la determinazione della frequenza con cui questi si presentano nella popolazione bovina siciliana. Le maggiori differenze genetiche sono attese tra animali allevati in zone tra loro lontane e/o di specie diverse. GenAlEx (Genetic Analysis in Excel) rappresenta uno strumento utile per effettuare analisi di genetica di popolazione, in quanto si avvale di algoritmi per le elaborazioni di dati marcatori di distanze genetiche. MATERIALI E METODI Primers marcati FAM JOE NED RISULTATI - In questo lavoro gli autori presentano i dati di frequenza di un pannello standardizzato di marcatori genetici relativi a un gruppo di 100 campioni prelevati da bovini allevati in diverse parti della Sicilia e rappresentativi della popolazione autoctona (n=23 cinisare, n= 77 meticci). La figura a lato mostra un esempio rappresentativo di picchi allelici ottenuti all'analizzatore genetico derivati dall'amplificazione degli alleli ai loci suggeriti. Le ripetizioni analizzate nel presente lavoro (STRs), sono tutte caratterizzate da motivi dinucleotidici che formano delle unità di ripetizioni semplici o strutture variabili. All'interno di ciascuno locus è possibile rintracciare un numero discreto di varianti alleliche (picchi) che nel loro insieme rappresentano e caratterizzano i soggetti. Il risultato dell'indagine è rappresentato in una tabella generale, in formato excel, (dati non mostrati) che raccoglie tutti i picchi e le relative frequenze alleliche. Tali dati rappresentano il punto di partenza per dimostrare, entro un opportuno intervallo di confidenza e con un probabilità del 95-99%, la paternità/maternità o l'identità tra due soggetti. Per la validazione del metodo applicato alla tracciabilità genetica individuale, è stata effettuata un’analisi statistica finalizzata al calcolo della probabilità di identità sulla base delle frequenze alleliche calcolate sui 100 campioni analizzati e sul riarrangiamento casuale degli alleli secondo Hardy-Weinberg. La numerazione attribuita a ciascuno degli alleli è ovviamente arbitraria e si rinnova all'interno di ogni locus, in ordine crescente del peso molecolare e di conseguenza in termini di paia di basi. In tale lavoro è stato riscontrato un elevato grado di polimorfismo al locus TGLA122, in concomitanza ad una elevata frequenza dell’allele 5. Questo risultato potrebbe spiegare gli incroci tra bovini autoctoni siciliani e soggetti di altre razze. Differentemente, al locus ETH10, si riscontra poca variabilità ed elevata frequenza degli alleli 9, 10 e 11. Inoltre l’allele 5, al locus SPS115, è spesso rappresentato nella maggior parte degli allevamenti siciliani. Nel caso dell'indagine di parentela, si va a verificare l'ipotesi di verosimiglianza. Se esiste una concordanza almeno del 50% tra i profili messi a confronto, si rende necessario calcolare la probabilità di paternità/maternità mediante approccio statistico proposto da Marshall et al. (1998). Si può dunque asserire che, per gli accertamenti di identità e per l’attribuzione di parentela si sfrutta il fatto che in ciascun locus può esserci una diversificazione in termini di abbondanza relativa di alcuni alleli e che tale dato mette in evidenza le differenze genetiche esistenti tra soggetti allevati in diverse regioni del paese. I risultati ottenuti in questo lavoro riguardano prevalentemente la creazione di una banca dati di variabilità genetica mediante analisi di un numero di campioni per ciascuna razza. Questi dati mostrano infatti come alcuni alleli siano uniformemente distribuiti all’interno della popolazione mentre altri si ritrovano in modo assolutamente discontinuo. . Bibliografia 1. Barendse W., Armitage S.M. & Kossarek L.M. (1994) A genetic linkage map of the bovine genome. Nature Genetics 6, 227. 2. Bishop M.D., Kappes S.M., Keele J.W. et al. (1994) A genetic linkage map for cattle. Nature Genetics 136, 619–39. 3. Georges M. & Massey J. (1992) Polymorphic DNA markers in Bovidae. World Intellectual Property Organization, Geneva (Patent application WO PUBL NO 92/13102). 4. Steffen P., Eggen A., Dietz A.B., Womack J.E., Stranzinger G. & Fries R. (1993) Isolation and mapping of polymorphic microsatellites in cattle. Animal Genetics 24, 121. XIV Congresso Nazionale S.I.Di.L.V. Sorrento (NA), 24-26 Ottobre 2012