Principi della centrifugazione Materiali differenti per forma, densità e dimensioni, sedimentano a diverse velocità se posti in un campo di forza centrifuga Sospensione Campo gravitazionale indotto con la centrifugazione Precipitato (pellet) Sopranatante Separazione completata

Principi della centrifugazione Le particelle in soluzione se lasciate in condizioni di quiete tenderanno a sedimentare per effetto della gravità Una centrifuga è uno strumento progettato per produrre una forza centrifuga superiore alla forza di gravità terrestre Obiettivo: esercitare una forza maggiore del campo gravitazionale terrestre aumentando la velocità di sedimentazione delle macromolecole, col fine di separare macromolecole che differiscono per densità, forma e dimensioni

In una centrifuga su una particella di massa m ruotante ad una velocità angolare ω a distanza r dall’asse di rotazione agisce una forza verso l’esterno e perpendicolare all’asse di rotazione: Fc= m ω2 r Fc= forza centrifuga ω2 r= velocità angolare che definisce il campo centrifugo G= ω2 r Solitamente, però, la velocità angolare del rotore viene espressa in rpm (rivoluzioni per min), dove una rivoluzione del rotore è pari a 2 p radianti, e, la forza centrifuga come forza centrifuga relativa RCF, cioè multiplo della forza di gravità agente sulla particella

RCF = Fc /Fg = m w2r / mg = w2r/ g Considerando la forza di gravità Fg , pari al prodotto della massa m per l’accelerazione di gravità g , cioè: Fg = mg si può esprimere la forza centrifuga come RCF (forza centrifuga relativa) pari ad un multiplo della forza di gravità, cioè : RCF = Fc /Fg = m w2r / mg = w2r/ g La forza centrifuga relativa è il rapporto tra il peso di una massa nel campo centrifugo ed il peso della stessa massa sottoposta alla sola azione del campo gravitazionale

Esprimendo la velocità angolare w come rpm (w = 2p RPM/60) ed inglobando i termini noti in un’unica costante avremo alla fine la seguente equazione RCF = 1.119 x 10-5 (rpm)2 r Quindi risulta che la RCF agente su una qualsiasi particella è funzione solo della velocità di rotazione e della distanza della particella dall’asse di rotazione. Pertanto particelle sottopose alla stessa RCF sedimenteranno con una velocità che dipenderà essenzialmente dalla loro densità

Centrifughe Centrifuga da banco Ultracentrifuga

Centrifughe Da banco 4000-6000 3000-7000 Micro max. 16000 max. 22000 RPM g Da banco 4000-6000 3000-7000 Micro max. 16000 max. 22000 Super ~ 25000 ~ 60000 Ultra ~ 80000 ~ 600000

Rotori ad angolo fisso - hanno gli alloggiamenti per i tubi disposti circolarmente attorno all’asse di rotazione ad un certo angolo prefissato che varia in genere tra 20° e 40°. Quando le particelle sono proiettate contro le pareti, scivolano verso il fondo con la formazione del pellet.  Coperchio del rotore (a tenuta d’aria) Coperchio del tubo da centrifuga Asse di rotazione

  Rotori oscillanti o ad angolo mobile - A riposo, i tubi rimangono in posizione orizzontale, ma quando il rotore inizia a girare, per effetto della accelerazione centrifuga, i tubi ruotano sui perni verso l’esterno, disponendosi orizzontalmente. I rotori oscillanti consentono una formazione di bande di sedimento ben differenziate e di pellets più uniformi ma hanno una maggiore delicatezza rispetto ai rotori ad angolo fisso.

Le tecniche centrifugative si possono suddividere in generale in preparative e analitiche. Preparativa: permette di separare e purificare cellule intere, organuli subcellulari e macromolecole biologiche, come acidi nucleici o proteine. Analitica: permette invece di studiare le caratteristiche di sedimentazione del campione e di determinarne il grado di purezza o la massa molecolare.

Centrifugazione differenziale La centrifugazione differenziale è la tecnica più usata per il frazionamento cellulare, cioè per l’ottenimento di preparazioni di organelli da sottoporre poi a studio. Ad esempio, centrifugando un omogenato cellulare per tempi relativamente brevi ed a velocità modeste sarà possibile ottenere la sedimentazione dei nuclei ma non degli altri organelli, che hanno densità e/o dimensioni minori e che rimarranno nel sovranatante. Il sovranatante può essere ulteriormente processato per ottenere altri tipi di particelle. Mediante l’applicazione ripetuta di questo procedimento, con l’aumento della velocità e del tempo di centrifugazione, si può ottenere la successiva sedimentazione di particelle sempre più piccole.

Separazione su gradiente di densita’ Il campione viene fatto stratificare su un gradiente pre-formato in una provetta mediante il mescolamento in proporzioni diverse di soluzioni a diversa densità. La densita’ massima non deve superare quella delle particelle piu’ dense da separare campione Particelle a bassa densita’ Particelle ad alta densita’ Campo centrifugo G R A D I E T

Elettroforesi Tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso verso il catodo (particelle cariche positive= cationi) verso l’anodo (particelle cariche negative= anioni) - + + + - +

Mobilità elettroforetica I fattori che influenzano la mobilità di una molecola in un campo elettrico comprendono la carica della molecola (q), il gradiente di voltaggio del campo elettrico (E), la resistenza di attrito del mezzo di supporto (f) La velocità (v) di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico è data dunque dalla seguente equazione: v = Eq f

Comunemente è adoperato il termine mobilità elettroforetica (μ) dello ione, che equivale alla velocità dello ione diviso l’intensità del campo elettrico (v/E) Quando si applica una differenza di potenziale, molecole con carica elettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione della loro mobilità elettroforetica Anche molecole con carica elettrica uguale, ma con dimensioni molecolari differenti, si separeranno per effetto di forze frizionali diverse

Apparecchiatura per elettroforesi Alimentatore elettrico Cella elettroforetica supporto

Materiali di supporto Acrilammide Per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gel di poliacrilammide o di agarosio I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantità di N,N’-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide). La bis-acrilammide, composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene, è utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (cross-linking agent). Acrilammide Acrilammide Bis-acrilammide

Il processo di polimerizzazione dell’acrilammide è un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con l’aggiunta di ammonio persolfato e della base N,N,N’,N’-tetrametilendiammina (TEMED). Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioè una molecola con un elettrone spaiato), nel modo seguente: TEMED (iniziatore) L’ammonio persolfato è l’estere disolfato dell’acqua ossigenata e omolisa rapidamente a radicali instabili (radicali solforici). Il TEMED è un’ammina terziaria che reagisce con questi radicali a formare radicali liberi TEMED, che a loro volta reagiscono con l’acrilammide inducendone la polimerizzazione. Se rappresentiamo il radicale libero con R· ed il monomero di acrilammide con M, possiamo schematizzare la polimerizzazione nel modo seguente: R· + M → RM· RM· + M → RMM· RMM· + M → RMMM· ecc.

In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dall’inserzione occasionale all’interno della catena di molecole di bis-acrilammide. GEL DI POLIACRILAMMIDE (molto idrofilico => trattiene grosse quantità di acqua) TEMED (iniziatore) (catalizzatore) Acrilammide bis-acrilammide

Elettroforesi denaturante o SDS PAGE nativa Elettroforesi denaturante o SDS PAGE Per semplificare l’analisi di miscele di proteine è possibile fare in modo che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensioni delle catene polipeptidiche. Ciò si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Solfato (SDS). Tale detergente si lega con forza alle proteine, le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS. La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente si baserà quasi esclusivamente sulle dimensioni delle molecole proteiche per cui proteine più piccole si muovono più rapidamente attraverso il gel, mentre quelle con dimensioni maggiori sono più rallentate e migrano più lentamente.

Sodio Dodecil Solfato CH3(CH2)10CH2OSO3- Na+ proteina

Elettroforesi

Elettroforesi in condizioni native Separazione di proteine, preservando la loro attività biologica Le proteine conservano la loro carica nativa, si separano mediante le loro differenti mobilità elettroforetiche e gli effetti setaccio del gel Esempio: separazione dei complessi della catena respiratoria in un gradiente lineare o esponenziale

Elettroforesi in condizioni native SDS PAGE I V III II IV I V III IV

Isoelettrofocalizzazione Separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico. In un gel viene creato un gradiente di pH mediante l’aggiunta di appropriati anfoliti La miscela di proteine viene posta in un pozzetto sul gel e viene applicato un campo elettrico. Le proteine entrano nel gel e migrano fino a che non raggiungono un pH equivalente al punto isoelettrico Le proteine con punti isoelettrici diversi si distribuiscono in punti diversi nel gel

Applicazioni dell’SDS-PAGE Analisi quantitativa delle proteine presenti nel campione di interesse Determinazione del peso molecolare di proteine sconosciute Analisi qualitativa delle proteine presenti nel campione di interesse (colorazione con Coomassie o nitrato d’argento, o western-blotting)

Tecniche di rivelazione Il gel è immerso in una soluzione che contiene Coomassie Brilliant Blue R-250 sciolto in acido acetico diluito e metanolo. Rivela 0,1 mg di proteina Coomassie Brilliant Blue Il gel si colora con una miscela di sali d’argento e formaldeide.Gli ioni d’argento reagiscono con i gruppi basici e tiolici delle proteine. 100 volte più sensibile Silver

WESTERN BLOT Al termine della corsa elettroforetica le proteine sono trasferita su un filtro di nitrocellulosa mediante una procedura definita elettroblotting Il gel e la nitrocellulosa sono posti in un apposito cestello a forma di sandwich immerso in un tampone nel quale ci sono due elettrodi paralleli La corrente, in direzione perpendicolare al gel, trasferisce le proteine sul foglio di nitrocellulosa

St C1 C2 C3 C4 C5 C6

Elettroforesi delle sieroproteine

Cromatografia Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo. Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale dei vari componenti fra due fasi, una chiamata fase fissa o fase stazionaria e l’altra chiamata fase mobile o eluente, che fluisce in continuo attraverso la fase fissa.

Le fasi essenziali di un processo cromatografico sono 3: Caricamento del campione o della miscela da analizzare in una zona ristretta della fase stazionaria Eluizione della miscela dalla fase stazionaria per effettuare la separazione nei singoli componenti Rivelazione dei composti separati

In base alla forma del letto cromatografico Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular) Cromatografia planare (su carta, su strato sottile) In base allo stato fisico della fase mobile Cromatografia Liquida (LC) Gascromatografia (GC) In base al meccanismo di separazione Scambio ionico Esclusione Affinità

Forma del letto cromatografico Cromatografia su colonna: la fase stazionaria è contenuta all’interno di una colonna cilindrica, che può riempire completamente (colonna impaccata) oppure rivestirne la superficie interna (colonna tubulare) Cromatografia planare: la fase stazionaria è distribuita su una superficie piana, che può essere un supporto cartaceo (cromatografia su carta, PC) o una lastrina in vetro o altri materiali (cromatografia su strato sottile, TLC)

Gel filtrazione o esclusione molecolare Separa le proteine in base alle dimensioni: la matrice presente nella colonna è un polimero con molti legami crociati che generano pori con un diametro specifico. Le proteine più grandi potranno migrare nella colonna più velocemente in quanto non possono entrare nei pori dei granuli della matrice; il loro percorso sarà quindi diretto verso il fondo della colonna. Le proteine più piccole potranno invece entrare nei pori allungando il percorso che devono compiere per arrivare al fondo della colonna

Scambio ionico La matrice solida della colonna è un polimero sintetico contenente gruppi carichi (quelli con gruppi anionici sono detti scambiatori di cationi mentre quelli con gruppi cationici sono detti scambiatori di anioni) L’ affinità delle singole proteine del campione per i gruppi carichi sulla colonna dipende dal pH della soluzione (che determina lo stato di ionizzazione delle proteine) e dalla concentrazione di sali (in grado di competere con le cariche delle proteine) La separazione può essere ottimizzata variando gradualmente il pH o la concentrazione salina in modo da creare un gradiente di pH o un gradiente salino

Cromatografia per affinità Separa le proteine in base alla loro specificità di legame Le proteine sono trattenute sulla colonna solo se sono in grado di legarsi a uno specifico ligando ancorato alla matrice solida. Dopo aver allontanato dalla colonna le proteine che non si possono legare, la proteina viene eluita usando una soluzione contenente ligando libero