Spettroscopia UV-VIS Fluorescenza TECNICHE SPETTROSCOPICHE PER LO STUDIO DELLE PROTEINE TECNICHE SPETTROSCOPICHE PER LO STUDIO DELLE PROTEINE Spettroscopia UV-VIS Fluorescenza

La radiazione elettromagnetica La radiazione elettromagnetica è composta da un vettore campo elettrico e da un vettore campo magnetico che oscillano su piani perpendicolari tra loro ed alla direzione di propagazione Una radiazione elettromagnetica è caratterizzata da parametri quali energia, frequenza, lunghezza d’onda e intensità Per la doppia natura onda-particella, i fenomeni elettromagnetici possono essere spiegati sulla base di fotoni o quanti

Interazioni tra radiazioni elettromagnetiche e materia Gli elettroni molecolari possono essere distribuiti su vari livelli energetici, quando viene fornita energia attraverso una radiazione elettromagnetica l’elettrone passa da un livello energetico fondamentale ad un livello superiore (eccitato) spettro di assorbimento Quando l’elettrone ritorna allo stato fondamentale esso emette la stessa energia spettro di emissione DE = E1 – E2 = hu h = 6.63 x 10-34 Js costante di Planck u è la frequenza

Spettroscopia UV-visibile principi teorici Legge di Lambert-Beer Se una sostanza assorbente è parzialmente trasparente essa trasmette solo una parte della radiazione incidente la trasmittanza è il rapporto tra l’intensità della luce trasmessa e la luce incidente Intensità = numero di fotoni che incidono nell’unità di tempo T = I/Io L’assorbanza o estinzione è il log(10) del reciproco della trasmittanza Va da zero (100% T) a infinito (0% T) A = E = log (1/T) = log (Io/I) A = el cl el = coefficiente di assorbanza molare

Spettrofotometria La lunghezza d’onda viene selezionata tramite l’uso di prismi (scomposizione della radiazione mediante il fenomeno della rifrazione) o reticoli (scomposizione della radiazione mediante il fenomeno della diffrazione). In entrambi i casi essi costituiscono un monocromatore Spettrofotometro a singolo raggio Spettrofotometro a doppio raggio

Spettri di assorbimento Gli spettri di assorbimento nell’UV (200-400 nm) e nel visibile (400-700 nm) derivano dal tipo di transizione elettronica: elettroni delocalizzati di legami p di doppi legami carbonio-carbonio e dei doppietti elettronici spaiati di azoto e ossigeno. Cromoforo = parte di una molecola che dà origine ad uno spettro di assorbimento Doppi legami coniugati abbassano l’energia di transizione (frequenza più bassa) spostamento batocromo Diminuzione di doppi legami spostamento ipsocromo Abbassamento del massimo di assorbimento = spostamento ipocromico Innalzamento del massimo di assorbimento = spstamento ipercromico

Applicazioni della spettrofotometria Calibrazione di uno standard per determinazione concentrazione di una sostanzacromofora Spettri differenziali, aumentano la sensibilità a piccole variazioni di assorbanza dovute a modificazioni delle proprietà spettrali di una molecola

Spettri di assorbimento Gli spettri di assorbimento nell’UV (200-400 nm) e nel visibile (400-700 nm) derivano dal tipo di transizione elettronica: elettroni delocalizzati di legami p di doppi legami carbonio-carbonio e dei doppietti elettronici spaiati di azoto e ossigeno. Cromoforo = parte di una molecola che dà origine ad uno spettro di assorbimento

Spettri di assorbimento del NAD/NADH

Riduzione del NAD a NADH Nicotinammide Adenina Dinucleotide (ossidato) Nicotinammide Adenina Dinucleotide (ridotto)

Saggio per l’enzima alcool deidrogenasi CH3CH2OH + NAD+ CH3CH2O + H+ + NADH Etanolo Acetaldeide Poiché il NADH assorbe la luce a 340 nm, la velocità di catalisi dell’ADH può essere seguita tramite spettrofotometria. Attraverso la lettura dell’assorbanza a 340 nm, in funzione del tempo, dopo l’aggiunta dell’enzima ad una miscela di reazione opportuna si ottengono i dati necessari per calcolare la velocità iniziale. Vo = (DAbs/Dt)iniziale

Cosa stiamo misurando? [NAD] costante e alta [ADH] costante La produzione di NADH NAD+ NADH Lo spostamento della lunghezza d’onda Dipendenza dalla presenza di ADH e Etanolo NAD non deve essere il fattore limitante della velocità di reazione [NAD] costante e alta [ADH] costante [ETOH] bassa e variabile Note sull’ADH: PM = 141000 – 148000 pI = 5.4 pH ottimale = 8.4-9.5 l’ADH ha struttura quaternaria con quattro subunità che legano ognuna uno ione zinco. L’enzima contiene 36 gruppi –SH quattro dei quali sono disposti nel sito attivo

Protocollo NAD 27.7 mM (20 mg in 1 ml H20) Calcoli la concentrazione di substrato: M = d * %Vol * 10 /PM Etanolo PM = 46 Metanolo PM = 32 Coefficiente di estinzione del NADH a 340 nm 6.22 mM-1 cm-1 2 bianchi Prova 1 Prova 2 Prova 3 Prova 4 Prova 5 Prova 6 NAD 70 Tampone 923 918 913 908 903 898 888 Etanolo - 5 10 15 20 25 35 ADH 7 Volume totale

Misura della velocità inziale Vo a varie concentrazioni di subtrato

Grafico dei Doppi reciproci

Fluorimetria In seguito ad una transizione energetica tra lo stato fondamentale ed uno stato eccitato di un sistema molecolare si verifica una competizione tra processi di rilassamento termico e riemissione della radiazione elettromagnetica, che determina il fenomeno della fluorescenza. Diagramma di Jablonski La transizione elettronica che dà origine alla fluorescenza si verifica in 10-8 s, mentre la transizione dallo stato di tripletto T1 allo stato di singoletto (S0), essendo proibita, avviene con una velocità di diversi ordini di grandezza inferiore.

spostamento (shift) di Stokes La fluorescenza La lunghezza d’onda della radiazione assorbita è inferiore rispetto a quella emessa in fluorescenza, tale differenza è chiamata spostamento (shift) di Stokes Le radiazioni emesse appaiono come spettri a banda perché molti sono i valori di lunghezza d’onda vicini che dipendono dai livelli finali di energia vibrazionale e rotazionale raggiunti.

La fluorescenza Efficienza quantica: quanti di fluorescenza emessi quanti assorbiti A basse concentrazioni è valida la relazione: If = 2.3 Io el c d Q If = intensità di fluorescenza Io =intensità della radiazione incidente el = coefficiente di estinzione molare c = concentrazione della soluzione fluorescente d = percorso ottico della radiazione nella soluzione fluorescente Per misure quantitative si deve allestire una curva di calibrazione

Fluorimetria E’ una tecnica particolarmente sensibile che permette di lavorare a basse concentrazioni. I problemi connessi a questa tecnica sono: la sensibilità al pH sensibilità alla temperatura sensibilità alla polarità del solvente fenomeni di smorzamento (quenching) Il quenching è il fenomeno associato al trasferimento dell’energia di eccitazione (che dovrebbe essere emessa come fluorecenza) ad altre molecole per interazione collisionale

Fluorimetria: la strumentazione Si usano due monocromatori, uno per selezionare la lunghezza d’onda di eccitazione (M1) ed uno per la lunghezza d’onda di emissione (M2) L’emissione avviene in tutte le direzioni, viene scelta la direzione a 90° rispetto alla direzione di eccitazione per evitare problemi di interferenza con la radiazione assorbita

Fluorimetria: applicazioni Fluorescenza intrinseca: quella posseduta naturalmente dal composto in esame Fluorescenza estrinseca: ottenuta per accoppiamento con una sonda fluorescente Esempi di sonde fluorescenti: Si legano fortemente ad un sito specifico del composto in esame, sono sensibili ai cambiamenti ambientali. Es. derivatizzazione degli aminocidi con dabsil cloruro per la mappatura peptica

Applicazioni della fluorescenza Cambiamenti conformazionali delle proteine Il Trp è il principale residuo aminoacidico responsabile della fluorescenza delle proteine. Essendo molto sensibile all’ambiente che lo circonda è possibile utilizzare la fluorescenza intrinseca del Trp per osservare cambiamenti dello spettro di emissione in risposta a cambiamenti conformazionali, associazione tra subunità, legame di substrati, denaturazione.. tutto ciò che è in grado di modificare l’ambiente circostante l’anello indolico del Trp.

Applicazioni della fluorescenza Binding di ligandi Cambiamenti di fluorescenza della proteina (Trp, Tyr, Phe) Cambiamenti di fluorescenza del ligando se fluorescente

Applicazioni della fluorescenza

Fluorescenza: effetto del solvente Effetto del solvente sui livelli energetici dello stato fondamentale e su quello eccitato Generalmente lo stato eccitato di composti aromatici possiede un momento di dipolo maggiore dello stato fondamentale a causa del riarrangiamento degli elettroni. Da ciò risulta che in seguito all'assorbimento della radiazione elettromagnetica da parte di un fluoroforo, si ha la creazione istantanea di un dipolo, il quale apporta delle perturbazioni sull'ambiente che lo circonda. In seguito all'eccitazione il solvente reagisce riorganizzandosi nell'intorno di solvatazione del fluoroforo Questo processo è chiamato rilassamento del solvente ed equivale ad una conversione dell'energia dello stato eccitato in energia di solvatazione

Fluorescenza: effetto del solvente

La fluorescenza dell’anello indolico del Trp è sensibile alle variazioni di polarità del solvente Il tipo di spettro della proteina nativa suggerisce che l’anello indolico è protetto dal solvente, la denaturazione in presenza di guanidina -HCl provoca uno spostamento della lmax a 351 nm, caratteristica del Trp completamente esposto

Applicazioni della fluorescenza Quenching collisionale Quenching collisionale di un residuo di Trp W1 protetto al solvente, e di un Trp W2 esposto al solvente Il quenching delle proteine è stato estesamente utilizzato per determinare il grado di esposizione dei residui di Trp al solvente. Il quenching collisionale comporta un contatto molecolare tra fluoroforo e agente quenchante: un quenchante solubile in acqua non è in grado di penetrare all’interno della struttura proteica.

Quenching collisionale di una proteina che contiene due Trp

La sonda ANS (1-anilino-8-naftalene sulfonato): fluorescenza estrinseca L’immagine mostra una soluzione acquosa di ANS in presenza di proteina BSA (sinistra) e in assenza di proteina (destra) eccitata dalla luce ultravioletta

Proprietà di ANS (1-anilino-8-naftalene sulfonato) Gli spettri di emissione di molti fluorofori sono altamente sensibili alla polarità dell'ambiente che li circonda. Lo spettro di emissione della sonda fluorescente ANS, per esempio, si sposta verso lunghezze d'onda maggiori (red shift) all'aumentare della polarità del solvente. Lo spettro di emissione di ANS in un solvente apolare come l'ottanolo presenta il massimo attorno a 462 nm; aumentando la polarità del solvente esso si sposta a lunghezze d'onda crescenti, si sposta a 476 nm in metanolo, fino a 512 nm in acqua. Parallelamente diminuisce l'intensità della radiazione

Uso di ANS per lo studio di cambiamenti conformazionali delle proteine ANS si lega a siti di binding apolari di proteine; attraverso l'analisi dello spettro di emissione é possibile ottenere informazioni sul grado di polarità del sito di binding. Es. spettri di fluorescenza della SE-DHFR + ANS in assenza ed in presenza di urea 8M 476 nm 520 nm

Poiché non si osserva uno shift verso lunghezze d'onda maggiori del massimo di emissione del complesso proteina-ANS, sembra possibile affermare che il microambiente intorno la sonda non aumenti in polarità. Tale dato indica una sostanziale protezione di questa regione nei confronti del solvente. Il parametro di fluorescenza che varia all'aumentare della temperatura sembra essere solamente l'intensità di emissione. Tale decremento dell'intensità dello spettro di emissione potrebbe essere spiegato in termini di quenching della fluorescenza di ANS, all'aumentare della temperatura.

Applicazioni biochimiche della fluorescenza Saggi enzimatici Struttura delle proteine Struttura delle membrane Trasferimento di energia per misurare distanze intramolecolari