IV LEZIONE Dati d'espressione genica: ESTs SAGE Microarray NCBI GEO

ESPRESSIONE DEL GENOMA UMANO NELLE CELLULE DIFFERENZIATE Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso corredo genomico L’espressione genica tessuto specifica determina il fenotipo morfo-funzionale dei tipi cellulari e tissutali In ogni cellula differenziata ed in ogni particolare momento dello sviluppo e’ attivo solo un sottoinsieme di geni

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA Puo’ agire su ciascuno dei livelli che caratterizzano il passare dell’informazione genica dal DNA alle proteine Negli Eucarioti superiori la regolazione dell’espressione genica si svolge principalmente come controllo della trascrizione Principali tipi di regolazione: Controllo epigenetico Controllo trascrizionale Controllo post-trascrizionale

METODI PER LO STUDIO SU LARGA SCALA DELL’ESPRESSIONE GENICA Sequenziamento sistematico di ESTs da librerie di cDNA SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) cDNA microarrays

“Large-scale approach” “One-gene approach” Il gene di interesse e’ espresso in un tessuto o in un dato momento dello sviluppo ? Quanto e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ? Real Time PCR PCR semiquantitativa Ibridazione DNA genico o cDNA con RNA totale o poly(A)+RNA (Northern blot) Ibridazione in situ “Large-scale approach” Quali geni sono espressi in un tessuto ed in un dato momento dello sviluppo ? Quanto ciascuno di essi e’ attivo dal punto di vista trascrizionale ? Profilo d’espressione del genoma (TRASCRITTOMA)

EST EST SEQUENCING mRNA of different genes cDNA LIBRARY

EST Il sequenziamento del DNA “codificante” si basa sulla purificazione dell'RNA messaggero da cellule o da campioni di tessuto e sulla sua retrotrascrizione in vitro in una sequenza di DNA complementare (cDNA). In genere i cDNA vengono frammentati e clonati in vettori batterici. Si ottengono in questo modo delle collezioni di batteri, nelle quali ogni colonia contiene un inserto corrispondente ad un frammento di sequenza di un gene espresso, dette librerie di cDNA.

Mappaggio di nuovi geni EST Utilità delle EST Scoperta di nuovi geni Mappaggio di nuovi geni Identificazione degli esoni lungo estese sequenze genomiche (Gene Prediction) Studio dello splicing alternativo

EST Una libreria di cDNA, che viene preparata dal messaggero contenuto nelle cellule di uno specifico tessuto, può essere considerata come un'istantanea che riproduce la composizione della popolazione dei messaggeri presenti nel tessuto in un particolare momento dello sviluppo dell'organismo e in determinate condizioni fisiologiche. Le librerie di cDNA in cui i cloni da sequenziare vengono scelti in modo casuale e sulle quali non vengono effettuate né operazioni di sottrazione né di normalizzazione, possono essere usate per descrivere, sia qualitativamente sia quantitativamente, la popolazione dei messaggeri.

EST

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ESTIMATE OF THE LEVEL OF EXPRESSION OF A GIVEN GENE UniGene Human Release Statistics Total sequences in clusters: 3115711 Total number of clusters sets: 95928 22094 sets contain at least one known gene 94710 sets contain at least one EST 20876 sets contain both genes and ESTs ESTIMATE OF THE LEVEL OF EXPRESSION OF A GIVEN GENE Sample of 12919 ESTs corresponding to 4460 genes/trascripts eg. Rhodopsin: 65 retina ESTs  65 / 12919 = 0.503%

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SAGE Serial Analysis of Gene Expression SAGE è un metodo sperimentale ideato per utilizzare i vantaggi del sequenziamento su larga scala con il fine di avere informazioni quantitative di espressione genica (Velculescu et al. 1995, Zhang et al, 1997) Con questa tecnica e’ possibile stimare il livello d’espressione di ciascun gene, attraverso la misura del numero di volte in cui la TAG che lo rappresenta compare in un campione abbastanza grande di TAGs sequenziate a partire dal messaggero del tessuto in analisi Tag to Gene mapping  Gene to Tag mapping Consiste nel sequenziamento da messaggeri cellulari di brevi oligonucleotidi, che fungono da etichette di sequenza (TAG)

SAGE Si basa su tre principi: una sequenza di 9 paia di basi permette di identificare 49 (262144) diversi trascritti, dal momento che una "tag" viene ottenuta da una posizione specifica di ogni trascritto (12bp) le "tag" possono essere unite insieme in serie, a costituire lunghe molecole di DNA, che vengono clonate e sequenziate in modo automatizzato il numero di volte in cui una singola "tag" viene osservata permette di quantificare l'abbondanza del messaggero identificato nella popolazione dei messaggeri e, indirettamente, il livello di espressione del gene corrispondente.

SAGE Una TAG e’ una sequenza di lughezza definita direttamente adiacente al 3’ del sito di restrizione piu’ 3’, nel messaggero da cui proviene, per l’enzima utilizzato (spesso NIaIII) Sintesi DNA a doppia elica a partire dai messaggeri con primer oligo(dT) biotinilato Taglio con enzima di restrizione e isolamento della porzione 3’ del cDNA per purificazione mediante sfere a streptavidina Separazione del cDNA in 2 aliquote, ciascuna ligata con un linker diverso, contenente un sito di taglio per un enzima di restrizione (tagging enzyme) che taglia ad una distanza definita dal sito riconociuto (20bp) Il linker con attaccato un breve tratto di cDNA (9-12 bp) viene rilasciato Ligazione tags a due a due ed eliminazione ditags con due elementi uguali Taglio ditags in modo da creare estremita’ coesive (spaziatore di 4 bp) Ligazione ditags in lunghi concatameri Clonaggio dei concatameri e sequenziamento Analisi automatizzata dei risultati: identificazione di tutte le specie di tags, conteggio della frequenza di ciascuna, assegnazione a sequenze geniche note ed annotazione

SAGE

SAGE Il risultato della SAGE e’ di tipo digitale: una lista di tags e la frequenza di ciascuna di esse La fase in cui si stabilisce la corrispondenza tra tag e gene e’ cruciale per una corretta stima del livello d’espressione del gene La corrispondenza tag-gene non e’ sempre biunivoca, come ci si aspetterebbe Gli errori di sequenziamento hanno effetti molto pesanti sui dati SAGE (1%  10% che ci sia almeno 1 errore su 10 bp) Le assegnazioni tag/EST sono affette da un errore maggiore Nel caso di due tag assegnate al medesimo gene: Reliable mapping  correzione per gli errori di sequenza sulle ESTs

SAGE

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Esperimenti di Microarray Permettono l’analisi dell’espressione genica di migliaia di geni simultaneamente

MICROARRAY Un esperimento

Misura dell’espressione dei geni con i microarray = malato = sano Gene 1 Gene 2

Analisi dell’immagine MICROARRAY Analisi dell’immagine Identificazione della posizione degli spot Costruzione di un’area locale intorno ad ogni spot Calcolo dell’intensità di ogni singolo spot Calcolo del background locale

MICROARRAY Elaborazione dei dati

EST SAGE MICROARRAY

Matrice dei risultati con più condizioni sperimentali … Cond. m Gene 1 x11 x12 x1m Gene 2 x21 x22 x2m Gene n xn1 xn2 xnm Quali geni sono differenzialmente espressi ? Quali e quanti geni sono coespressi?

Obiettivi dell’analisi saranno… Identificazione geni differenzialmente espressi Identificazione pattern di espressione comuni Identificazione di geni coespressi con geni di funzione nota

I geni sono punti nello spazio: CLUSTER ANALISI Identificazione di gruppi di geni con profili di espressione simili Simili rispetto a cosa ? distanza Definizione di I geni sono punti nello spazio: punti vicini nello spazio sono raggruppati insieme

CLUSTER ANALISI Misura di similarita’ Linking method DUE STEPS: Diverse misure Standardizzazione dei dati Linking method criterio per stabilire i gruppi Metodi gerarchici e non gerarchici