DIVERSITA’ BIOMOLECOLARE DI PIANTE OFFICINALI SICILIANE Consiglio Nazionale delle Ricerche Istituto di Chimica Biomolecolare – Valverde CT Giuseppe Ruberto La ricerca multidisciplinare a sostegno della filiera delle piante officinali DIVERSITA’ BIOMOLECOLARE DI PIANTE OFFICINALI SICILIANE Aspetto salutistico delle Piante Officinali e loro utilizzo in naturopatia Catania, 24 Novembre 2008, Le Ciminiere, V.le Africa, Piazzale Asia

LA CHIMICA DEI PRODOTTI NATURALI La chimica dei prodotti naturali è probabilmente la più vecchia branca della chimica organica. Il suo sviluppo si deve alla curiosità verso l’attività biologica manifestata da questi composti, l’ampia diffusione delle medicine popolari, il loro aroma, etc., che inizialmente ha indotto al loro isolamento e determinazione strutturale, e successivamente alla loro sintesi e allo studio dei meccanismi biosintetici che li producono. Con il rapido sviluppo, in questi ultimi decenni, delle tecniche di isolamento, della cromatografia e della spettroscopia, la determinazione della struttura, in molti casi, è divenuta quasi una metodologia routinaria, anche se rimane il primo ed essenziale passo per qualsiasi ulteriore sviluppo. Dopo un iniziale periodo in cui l’isolamento è stato principalmente casuale, oggi si persegue sempre più un isolamento guidato dall’attività biologica, e dato che la maggior parte delle sostanze naturali esercita qualche tipo di bioattività, l’interesse oggi è rivolto verso le origini di tale bioattività e sulle interazioni che intercorrono fra i prodotti naturali e i siti recettoriali.

COSA SONO I PRODOTTI NATURALI Metabolismo Primario carboidrati lipidi proteine acidi nucleici coenzimi FUNZIONI NUTRIZIONALI Metabolismo Secondario alcaloidi antrachinoni flavonoidi polifenoli steroidi terpeni PRODOTTI NATURALI FUNZIONI NON NUTRIZIONALI Oli essenziali Sono i prodotti naturali, noti anche come metaboliti secondari, i responsabili delle attività fitoterapeutiche di tutti i prodotti a base di erbe. Sono ancora i prodotti naturali, intesi anche come “marker biomolecolari”, a stabilire la ‘bontà’ di una specie vegetale officinale, ed allo stesso tempo quella di un suo qualsiasi derivato erboristico.

PROGETTO PIANTE OFFICINALI SICILIANE finocchio (frutti) rosmarino LE SPECIE ANALIZZATE finocchio (foglie) origano coriandolo timo zafferano salvia elicriso Finanziato da “Assessorato Agricoltura e Foreste – Regione Siciliana”

Salvia officinalis Olio Essenziale

Sette differenti popolazioni di Salvia officinalis (A – G) sono coltivati in tre differenti ambienti: Catania, Troina EN, Avola SR. S. officinalis tipo A S. officinalis tipo C S. officinalis tipo E Salvia triloba (wild)

ESTRATTI DI SALVIA Metaboliti secondari in estratti di salvia. Marker Classe M. W. b-Carotene Carotenoide 536 Luteina “ 568 Scutellarein Flavonoide 286 Hispidulin 300 Cirsimaritin 314 Genkwanin 284 Salvigenin 328 Carnosol Terpene 330 Carnosic Acid 318 Methyl Carnosate 332 Ethyl carnosate 346 Caffeic Acid Acido Organico 180 Rosmarinic Acid 360

Profili HPLC-UV-DAD di estratti di Salvia 450 nm Carotenoidi B Flavonoidi e Terpeni 280 nm 330 nm C Acidi organici A (n-esano), B (etil acetato), C (etanolo)

Confronto quali/quantitativo del contenuto di 13 markers biomolecolari in tre differenti popolazioni di S. officinalis

dominante dei seguenti gruppi di composti: ORIGANO - ORIGANUM Gli oli essenziali dei taxa di Origano sono caratterizzati dalla presenza dominante dei seguenti gruppi di composti:

GLI OLI ESSENZIALI DELL’ORIGANO SICILIANO 51 campioni di Origano provenenti da differenti ambienti Siciliani 1.8 – 6.6 % (v/w) il range di resa in olio essenziale – media 4.1% 81 componenti identificati; 34 – 54 il range di componenti identificati nei 51 campioni - media 47. Selezionati Componenti dei 51 Campioni di Origano #a Composto Range %b Inc 4 a-Thujene 1.25 - 3.17 51 21 g-Terpinene 8.29 - 53.47 5 a-Pinene 0.65 - 2.23 22 cis-Sabinene hydrate 0.12 - 2.28 7 Sabinene n.d. - 5.02 43 25 Linalol 0.15 - 3.88 8 b-Pinene 0.23 - 2.18 26 trans-Sabinene hydrate n.d. - 12.82 40 10 b-Myrcene 2.07 - 4.79 34 Terpinen-4-ol 0.50 - 9.58 14 a-Terpinene 2.53 - 6.80 38 a-Terpineol n.d. - 3.18 15 p-Cimene 3.15 - 18.67 42 Thymol methyl ether 0.13 - 6.05 16 Limonene 0.63 - 1.64 48 Thymol 10.52 - 54.42 17 1,8-Cineole n.d. - 3.32 49 Carvacrol 0.19 - 8.28 18 b-Z-Ocimene n.d. - 3.29 47 54 b-Caryophyllene 0.57 - 3.97 20 b-E-Ocimene 0.14 - 6.61 65 b-Bisabolene 0.23 - 3.61 a Il numero si riferisce all’ordine di eluizione in GC; b n.d. = non determinato; c numero di campioni in cui il componente è presente.

Analisi cluster degli oli essenziali di origano thymol>> g-terpinene≥p-cymene thymol> g-terpinene>t-sabinene hydrate>terpinen-4-ol thymol≥ g-terpinene> p-cymene thymol>> g-terpinene> p-cymene thymol> g-terpinene> p-cymene g-terpinene>> thymol> p-cymene g-terpinene> thymol≥ p-cymene

ESTRATTI DI ORIGANO Metaboliti secondari in estratti di origano. Marker Classe M.W. Vanillic Acid Acido Organico 168 Rosmarinic Acid “ 360 Aromadendrin Flavonoide 288 Naringenin 272 Luteolin 286 Sorbifolin 300 Apigenin 270 Cirsimaritin 314 Xanthomicrol 344

Confronto di tre profili cromatografici (HPLC-UV-DAD) di tre differenti estratti in acetato di eile di campioni di Origano provenienti da differenti ambienti.

TIMO - THYMUS Thymus vulgaris L. è la più conosciuta specie di questo genere. Nella Farmacopea Europea è incluso solo il chemiotipo timolo/carvacrolo, le cui quantità oscillano fra 30-70% e 3-15%, rispettivamente. In Sicilia, la specie T. capitatus è quella spontaneamente più diffusa, essendo caratterizzata da un alto contenuto di carvacrolo. Olio essenziale

GLI OLI ESSENZIALI DEL TIMO SICILIANO 41 campioni di Timo provenienti da differenti ambienti Siciliani 3.9 – 8.8 % (v/w) il range di resa in olio essenziale – media 6.2% 38 componenti identificati; 27 – 37 il range di componenti identificati nei 41 campioni - media 33. Selezionati Componenti dei 41 Campioni di Timo #a Composto range %b inc 3 a-Pinene 0.56 - 1.04 41 19 Borneol n.d. - 1.13 40 6 Myrcene 1.16 - 2.10 20 Terpinen-4-ol 0.58 - 0.80 10 a-Terpinene 1.00 - 2.22 26 Thymol 0.14 - 0.39 11 p-Cymene 4.63 – 11.45 27 Carvacrol 65.26 - 81.27 14 g-Terpinene 2.10 - 9.09 29 b-Caryophyllene 1.34 - 4.25 17 Linalool 0.27 - 0.95 33 Z-a-Bisabolene n.d. - 0.75 35 a Il numero si riferisce all’ordine di eluizione in GC; b n.d. = not determinato; c numero di campioni in cui il componente è presente.

Analisi cluster degli oli essenziali di timo carvacrol >> p-cymene > g-terpinene g-terpinene ≈ 8% carvacrol ≈ 70% p-cymene ≈ 10% g-terpinene ≈ 3% carvacrol ≈ 80% p-cymene ≈ 5% g-terpinene ≈ 5% carvacrol ≈ 73% P-cymene ≈ 8% carvacrol ≈ 77% g-terpinene ≈ 4% p-cymene ≈ 6% carvacrol ≈ 75% g-terpinene ≈ 4% p-cymene ≈ 6%

ESTRATTI DI TIMO Metaboliti Secondari negli Estratti di Timo. Marker Classe M.W. Rosmarinic Acid Acido Organico 360 Apigenin 7-O-glucuronide Flavonoide 446 Vicenin-2 (Apigenin 6,8 di-C-glc) “ 594 Taxifolin di-O-glc* 628 Gardenin B glucoside* 520 Genkwanin rutinoside* 592 Apigenin 270 Eriodictyol 286 6-OH Luteolin 302 Luteolin Thymusin 330 Cirsilineol 344 Diosmetin 300 *corretto isomero non determinato

Sono noti tre differenti chemiotipi di olio essenziale di ROSMARINO - ROSMARINUS Sono noti tre differenti chemiotipi di olio essenziale di Rosmarinus officinalis: Tuttavia, l’olio essenziale, secondo la X F.U.I., deve contenere borneol (10 – 15%) e bornyl acetate (1.5 – 5.5%):

GLI OLI ESSENZIALI DEL ROSMARINO SICILIANO 41 campioni di Rosmarino provenienti da differenti ambienti Siciliani 0.7 – 2.8 % (v/w) il range di resa in olio essenziale – media 1.2% 93 componenti identificati; 30 – 67 il range di componenti identificati nei 41 campioni - media 49. Selezionati Componenti dei 41 campioni di Rosmarino #a  Composto range %b Inc #a 3 a-Pinene 2,21 - 39,83 41 24 Terpinolene n.d. - 3,55 26 4 Camphene 0,79 - 12,09 25 Linalool n.d. - 5,45 38 5 Thuja -2,4(10) Diene n.d. - 2,00 23 31 Camphor 2,55 - 30,53 9 b-Pinene n.d. - 5,10 17 34 Isoborneol n.d. - 4,37 12 b-Myrcene n.d. - 1,85 37 35 trans-3-Pinocamphone n.d. - 2,78 28 14 D-2-Carene n.d. - 2,83 10 Borneol n.d. - 17,72 36 15 a-Terpinene n.d. - 2,70 40 a-Terpineol n.d. - 4,65 16 p-Cymene n.d. - 2,61 39 45 Verbenone n.d. - 13,73 Limonene n.d. - 7,90 19 50 trans-Myrtanol n.d. - 2,68 18 1,8-Cineole 0,11 - 62,74 64 Caryophyllene –Z n.d. - 2,91 a Il numero si riferisce all’ordine di eluizione in GC; b n.d. = non determinato; c numero di campioni in cui il componente è presente.

Analisi cluster degli oli essenziali di rosmarino a-Pinene 30.52 1,8-Cienolo 25.37 Verbeneone 5.62 Canfora 5.53 Canfene 5.52 Borneolo 5.44 a-Pinene 33.03 Canfora 19.64 Canfene 9.96 Borneolo 7.78 Limonene 6.10 Verbenone 4.96 a-pinene 16.55 Canfora 13.13 1,8-Cineolo 10.49 Borneolo 10.88 Verbenone 9.98 1,8-Cineolo 43.62 a-Pinene 15.55 Canfora 10.94 Borneolo 8.90 Canfene 5.83 1,8-Cineolo 59.49 a-Pinene 13.25 Canfene 4.79 a-Terpineolo 4.27 Isoborneolo 4.02

ESTRATTI DI ROSMARINO Metaboliti Secondari negli Estratti di Rosmarino. Marker Classe MW Acido Caffeico Acido organico 180 Acido Rosmarinico “ 360 Luteolin glucoside Flavonoide 624 Luteolin glucuronide 630 Eupafolin-glucoside 478 Sorbifolin-glucoside 462 Luteolin-glucuronide Luteolin-glucuronide (acetil) 1 504 Luteolin-glucuronide (acetil) 2 Luteolin 286 Scutellarein Hispidulin 300 Cirsimaritin 314 Cirsimaritin isomero Genkwanin 284 Salvigenin 328 Carnosol Terpene 330 Carnosic Acid 318 Methyl Carnosate 332

per applicazioni in campo fitoterapico Studi molecolari e valorizzazione di risorse per il settore biomedico Individuazione e caratterizzazione di nuove molecole da specie vegetali per applicazioni in campo fitoterapico La liquirizia (Glycyrrhiza glabra L.) è una delle più conosciute piante medicinali nel mondo. La parte della pianta utilizzata come droga è rappresentata dalle radici (stoloni) essiccate. Essa è inclusa in molte farmacopee ufficiali di svariati paesi orientali dove sono descritti i principali usi terapeutici delle radici. Svariati composti triterpenici quali saponine(acido glicirrizico, acido glicirrizinico) e sapogenine (glicirretina, acido glicirretinico), insieme a flavoni, isoflavoni, calconi e composti correlati, sotto forma anche di glucosidi, sono stati isolati dalle radici di G. glabra e di specie congeneri. Questi composti sono considerati i principi attivi a cui si deve il largo numero di attività biologiche di questa pianta, i cui estratti sono utilizzati come tonici, antiflogistici, espettoranti ed analgesici. Al contrario, le parti aeree della pianta sono scarsamente utilizzate, e considerate un prodotto di scarto. Abbiamo pertanto analizzato l’estratto lipidico delle foglie di G. glabra raccolta in Sicilia. Esso è stato sottoposto alla valutazione della sua efficacia antiossidante misurando il valore dei perossidi (PV) in olio di semi di girasole commerciale. Questa indagine ha permesso di stabilire che la capacità protettiva dell’estratto lipidico di foglie di liquirizia è paragonabile a quella del 2,6-di-tert-butil-4-metilfenolo (BHT), uno dei più comuni antiossidanti sintetici (v. grafico). Variazione del valore dei perossidi (PV) di olio di semi di girasole con BHT (▲), estratto lipidico di foglie di liquirizia (■), bianco (♦).

per applicazioni in campo fitoterapico Studi molecolari e valorizzazione di risorse per il settore biomedico Individuazione e caratterizzazione di nuove molecole da specie vegetali per applicazioni in campo fitoterapico Sulla base degli incoraggianti risultati sull’attività antiossidante, i diidrostilbeni più abbondanti (GA-23, PA-82, DO-07) sono stati sottoposti ad una serie di saggii per verificarne l’attività inibente sulle cicloossigenasi, COX-1 e COX-2, che come è ben noto sono coinvolte nei processi infiammatori. I composti finora analizzati hanno mostrato un’attività inibente, più o meno marcata, sulle COX-2 ma non sulla COX-1. Ulteriori studi sono in corso per confermare questa selettività, e stabilire delle correlazioni fra struttura ed attività. Percentuale di inibizione della COX-2 indotta dal lipopolisaccaride (LPS) da parte di alcuni stilbeni su sangue intero umano. Percentuale di inibizione della COX-1 da parte di alcuni stilbeni su sangue intero umano.

Mappatura per specie e per aree geografiche di provenienza dei campioni spontanei di piante officinali Origano Salvia Finocchio Rosmarino Timo 2006-2007

Alcune considerazioni 1051 campioni sono finora pervenuti a questa U.O. 941 (ca. 90%) sono stati gli essenziali ottenuti ed analizzati: origano, timo, rosmarino, finocchio, salvia, coriandolo; 386 gli estratti ottenuti ed in parte analizzati: salvia, timo, origano, rosmarino, zafferano. Emerge un quadro fitochimico abbastanza ampio, anche se ancora con alcune lacune, della flora aromatica aromatica siciliana sia allo stato spontaneo che coltivato. La tipicità e ricchezza fitochimica delle specie spontanee, evidenziate in questo studio, costituiscono un patrimonio da salvaguardare ed, allo stesso tempo, sfruttare. Per quel che concerne i campioni coltivati, studiati in misura minore, emerge un quadro non del tutto omogeneo, essendo il settore ancora caratterizzato da ampi livelli di improvvisazione, ed incertezze e di una ancora non adeguata conoscenza di quelli che possono essere gli sviluppi potenziali di questo settore.

Dott.ssa Laura Siracusa Dott.ssa Giusy Curcuruto Dott. Andrea Pasquale Dott. Edoardo Napoli Dott.ssa Laura Siracusa Dott.ssa Giusy Curcuruto Dott. Andrea Pasquale Sig.ra Tonia Strano Sig.ra Concetta Rocco Sig. Agatino Renda Sig. Antonio Giuffrida Assessorato Agricoltura e Foreste - Regione Siciliana Rao Erbe – San Gregorio CT