CITOGENETICA CONVENZIONALE E MOLECOLARE

CITOGENETICA CONVENZIONALE La citogenetica convenzionale è una tecnica che permette lo studio del numero e della struttura dei cromosomi (studio del cariotipo) I cromosomi vengono esaminati “bloccati” in metafase. Step: prelievo del campione (SP, BM o tessuto linf.) allestimento delle colture cellulari allestimento dei preparati bandeggio dei cromosomi

Allestimento delle colture e dei preparati Diretta: terreno di coltura+colchicina 4-6 ore Medio termine: terreno + colchicina 24-48 ore Sincronizzata: blocco in fase S (MTX) rimozione del blocco colchicina Tecniche di coltura post-incubazione: centrifugazione soluzione ipotonica per distensione dei cromosomi centrifugazione → fissativo (alcol metilico o acido acetico) Allestimento preparati

Tecniche di bandeggio dei cromosomi Bandeggio Q Bandeggio G Bandeggio R Tecniche generali (intero cromosoma) BANDEGGIO STATICO Bandeggio C Bandeggio Cd (fuso) Bandeggio NOR geni RNA ribosomi Tecniche speciali (porzioni cromosoma) Informazioni sul tipo di replica di ogni cromosoma durante la fase S (uso raro in onco-ematologia) BANDEGGIO DINAMICO

Bandeggio Q mostarda di chinacrina contrasto tra bande: scarso (intercala tra copppie di basi) contrasto tra bande: scarso non colora telomeri colora eterocromatina

Bandeggio R soluzione salina + Giemsa complementari a bande Q e G contrasto < a bandeggio G colora telomeri eucromatina colora poco eterocromatina

Cromosomi normali Cromosoma metacentrico Cromosoma submetacentrico acrocentrico

Cariotipo normale 46 cromosomi (n. diploide) 22 coppie (omologhi) autosomi (1-22) 2 cromosomi sessuali XY (M) e XX (F)

Anomalie cromosomiche quasi aploidi (n +/-) ipodiploidi (2n-) iperdiploidi (2n+) pseudodiploidi monosomie trisomie Anomalie del numero traslocazioni (reciproche e non) delezioni (intersiziali o terminali) duplicazioni inversioni Anomalie strutturali

Traslocazioni T (2;15) (p11.2;q11.2) T (13;14) (p11.2;p11.2) bilanciata sbilanciata

Delezioni cromosomiche (q11.23 q21.2) delezione interstiziale braccio lungo (q) cromosoma 7

CITOGENETICA MOLECOLARE (FISH) La Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) è una tecnologia che utilizza sonde nucleotidiche marcate (DNA probes) per identificare specifiche regioni di un cromosoma ovvero determinate sequenze del DNA. Step: denaturazione del DNA incubazione sonda + DNA denaturato (“annealing”) rilevazione del segnale della sonda con microscopio a fluorescenza

Tipi di sonde (DNA probe) Nucleotidi + biotina o digossigenina (fluorocromo + streptavidina) (fluorocromo + Ac anti-digossigenina) Sonde nucleotidi coniugati a fluorocromi Alfoidi: per sequenze ripetitive dei satelliti (anomalie numeriche) Painting: specifiche per un cromosoma (cromosomi molto riarrangiati) Locus singolo: sequenze specifiche DNA (es. geni di fusione) Sonde

FISH: tappe della metodica Campioni DNA: cromosomi in metafase o nuclei in interfase

FISH in interfase

FISH in metafase probe per parte terminale del cr. 4q

FISH: vantaggi e limiti Esamina elevato n. di cellule in tempi brevi Metodica semplice Elevata efficienza di ibridizzazione Elevata sensibilità e specificità Non necessità cellule in mitosi Correla dato citogenetico con morfologico Vantaggi Informazioni su singolo cromosoma/gene Esame simultaneo di pochi DNA bersaglio Soglia di positività da calcolare per ogni sonda Possibili artefatti nell’analisi di inclusi in paraffina Limiti

Citogenetica nelle leucemie acute Classificazione delle leucemie acute (entità cliniche all’interno di un citotipo FAB) Definizione del rischio citogenetico (significato prognostico) Monitoraggio della malattia minima residua: sensibilità citogenetica convenzionale < sensibilità FISH

TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Tecnica che si basa sulla capacità di una DNA polimerasi di amplificare in modo esponenziale una regione di DNA a sequenza sconosciuta (templato) posta tra due porzioni di DNA a sequenza nota. Step: Estrazione di DNA (o RNA) Cicli di amplificazione: denaturazione “annealing” estensione dei primers Analisi degli amplificati

PCR: estrazione di DNA (o RNA) Proteinasi + fenolo-cloroformio-alcool isoamilico time: 2 giorni DNA Guanidio isotiocianato + mercaptoetanolo cloroformio ( a 4 °C) time: 2 giorni RNA DNA/RNA KIT commerciali/ strumenti per automazione 260 nm (DNA) 280 nm (proteine) Concentrazione Qualità A 260 A 280 spettrofotometria

PCR: cicli di amplificazione Miscela di amplificazione DNA templato DNA polimerasi termostabile Buffer di reazione (TrisHCl e KCl) Ione magnesio Desossinucleotidi trifosfato Primers: brevi sequenze di DNA a singolo complementari a sequenze note poste a monte e a valle del templato

PCR: cicli di amplificazione Denaturazione (~ 1 min 95°C) Raffreddamento e “annealing” dei primers (~ 1 min 45-60°C) Estensione dei primers da DNA polimerasi (~ 1 min 72°C)

PCR: cicli di amplificazione Cicli ripetuti 25-45 volte

crescita esponenziale ed efficienza di reazione Amplificazione: crescita esponenziale ed efficienza di reazione Xn = X0 x (1 + Ex)n Qualità e concentrazione del DNA/RNA Qualità e concentrazione del cDNA Concentrazione dei vari reagenti Condizioni di temperatura della reazione Numero di cicli plateau Efficienza della reazione

PCR qualitativa: analisi dei risultati Elettroforesi in gel di agarosio Corsa: 1/2 ora a 150 V Colorazione con etidio bromuro UV transilluminazione Fotografia

Fig. 4 Roccaro et al. VEGF IL-6 GAPDH GAPDH Ang1 Ang2 IGF-1 GAPDH ddH2O 0 nM 5 nM 7.5 nM ddH2O 0 nM 5 nM 7.5 nM VEGF IL-6 GAPDH GAPDH 150 150 120 Interior area (pixel) 100 Interior area (pixel) 90 50 60 30 neg ctrl Bortezomib [nM] 5 7.5 neg ctrl Bortezomib [nM] 5 7.5 ddH2O 0 nM 5 nM 7.5 nM ddH2O 0 nM 5 nM 7.5 nM ddH2O 0 nM 5 nM 7.5 nM Ang1 Ang2 IGF-1 GAPDH GAPDH GAPDH 100 150 80 180 100 Interior area (pixel) 60 Interior area (pixel) 40 50 Interior area (pixel) 120 20 60 neg ctrl Bortezomib [nM] 5 7.5 neg ctrl Bortezomib [nM] 5 7.5 neg ctrl Bortezomib [nM] 5 7.5 Fig. 4 Roccaro et al.

PCR qualitativa: vantaggi e limiti Elevata sensibilità Elevata specificità Identificazione di traslocazioni non dimostrate dalla citogenetica Possibilità di analisi simultanea delle traslocazioni più frequenti Possibilità dell’esecuzione dell’analisi da campioni bioptici Vantaggi Possibilità di contaminazioni Efficienza di amplificazione variabile e dipendente da vari fattori Impossibilità di stabilire la q di sequenza bersaglio Presente all’inizio nel campione Limiti

PCR quantitativa real-time Thermal-cycler (amplificazione) Sistema ottico per rilievo della fluorescenza Software per raccolta ed analisi dei dati Analisi dei prodotti non alla fine della reazione, ma durante la fase di crescita lineare delle molecole di amplificato

Real-time PCR: metodo Taqman Sonda specifica per target Q = fluorocromo quencher (rosso, onda lunga) R = fluorocromo reporter (verde, onda corta) Sonda Taqman si lega a DNA target I primer si legano a 3’ e 5’ del DNA templato

Real-time PCR: metodo Taqman

Real-time PCR: metodo Taqman

Real-time PCR: metodo Taqman

PCR quantitativa: vantaggi e limiti Velocità Sensibilità (10-4 – 10-6) Specificità Standards commutabilità confrontabilità accuratezza Vantaggi Variabilità nella determinazione quantitativa Complessità sperimentale Mancanza di standards Valutazione critica dei risultati Limiti

TECNOLOGIA DEI MICROARRAY E LEUCEMIE ACUTE

DNA-microarray Metodica che consente di analizzare il profilo di espressione genica delle cellule. Procedura di base: Sequenze di DNA sono schierate in ordine su supporto solido. Dal campione viene estratto mRNA e retrotrascritto in cDNA. cDNA, marcato con tracciante fluorescente, ibridizza con sequenze su array. Il livello di espressione di un gene è direttamente proporzionale all’intensità di segnale derivato dalle immagini digitali acquisite. Principali tipi di microarray: 1. membrane based cDNA microarray 2. glass slide-based cDNA microarrays 3. oligonucleotide microarray o DNA chip

DNA-microarray e leucemie acute: possibili sviluppi Riclassificare le leucemie Individuare profili di espressione genica in relazione alla prognosi Individuare profili di espressione genica in relazione a vie di trasduzione del segnale per definire terapie molecolari target Individuare profili di espressione genica in relazione alla sensibilità o resistenza ad un dato farmaco