TERAPIA TARGET MOLECOLARE

Terapia target molecolare: razionale Molteplici difetti genetici coinvolti nell’oncogenesi Troppi target per una terapia molecolare efficace ? ! Interazione/interdipendenza di molte vie di trasduzione del segnale ! Riduzione del vantaggio proliferativo con l’inibizione di una singola via di trasduzione del segnale aberrante

Leucemia Mieloide Cronica Incidenza 1-2 casi ogni 100.000 abitanti per anno Diagnosi facile: quadro ematologico caratteristico marcatore citogenetico specifico

Cromosoma Philadelphia 22 Cromosoma Philadelphia 1960 - Nowell P.C. & Hungerford D.A

BCR/ABL rearrangement La traslocazione che da origine al cromosoma Ph avviene in una cellula staminale totipotente Ph-translocation BCR/ABL rearrangement My Ph-negative Stem Cell Clonal Expansion Ph-positive Stem Cell Ly B cell ometimes Ph+Myeloid Progenitors Ph+Lymphoid progenitors T cell Ph+ B-cells Proliferation Expansion T-cell Sometimes, Lymphoid blast crisis

Ph-translocation / BCR-ABL rearrangement Normal SC Normal SC Ph+SC Ph+SC Ph+SC EXPANSION OF THE Ph + STEM CELL COMPARTMENT CML Ph + progenitors & mature cells

Il cromosoma Philadelphia è il marcatore caratteristico della LMC (presente in più del 95% dei casi), ma si ritrova anche: in circa il 30% delle LLA dell’adulto nel 2% delle LMA

Conseguenze molecolari della traslocazione che determina la comparsa del Cromosoma Philadelphia bcr-bl 9+ 9 22 bcr abl

Schema del gene ABL e dei suoi domini funzionali Attività tirosin-kinasica Myr SH3 SH2 SH1 NLS DNA Actin binding binding 1a 1b Parte che migra sul cromosoma 22 Gene espresso in tutti i tessuti, la cui funzione nella cellula normale non è esattamente nota ? Riparo DNA ? Controllo ciclo cellulare e apoptosi ? Interazione con TP53

Gene BCR: qual è la sua funzione? Dimerization Domain Serine/threonine rich domain (SH2 bind.) dbl-like domain GAPrac domain Exon 1 Exon 3/8 Exon 17/22 m-bcr M-bcr µ -bcr Proteina bcr regione ad attività serina-treonina chinasica (dimeri) regione x passaggio GTP→GDP→attivazione fattori trascrizione residui tirosinici x autofosforilazione (legame a Grb2, adattatore per Ras) trasduttore di segnale

Punti di rottura sul cromosoma 22 Gene BCR m- bcr M-bcr µ-bcr e1 e6 e13 e14 e19 (b2) (b3) e20 Gene ABL a2

Tipi di gene ibrido BCR-ABL che si possono formare BCR ABL TK m-bcr P190 LLA BCR ABL TK M-bcr P210 CML, LLA BCR ABL TK µ-bcr P230 CML, CNL

Autophosphorylation of BCR-ABL Autophosphorylation by dimerization ABL Tyr BCR BCR ABL Tyr

Fosforilazione di proteine bersaglio da parte di BCR-ABL Bcr-Abl Proteina Tir Proteina P Tir P P ATP Trasduzione del segnale

matrice del midollo osseo 3- Inibizione della apoptosi Processi attivati dalla presenza di BCR-ABL nelle cellule del sangue dalla conseguente attivazione dell’attività tirosin chinasica di ABL RAS 1-Stimolo alla proliferazione BCR/ABL JAK-STAT MYC NUCLEO Paxillin F-actin 2-Diminuzione dell’adesione alla matrice del midollo osseo ABL 3- Inibizione della apoptosi Ciclo Cellulare PIK3-AKT 4-Diminuzione della funzione di ABL a livello nucleare: instabilità genomica

Clone indifferenziato, difetti genetici addizionali Progressione della Leucemia Mieloide Cronica ANNI 1 2 3 4 5 Ph+ Ph1 N Clone indifferenziato, crisi blastica Accumulo di difetti genetici addizionali

Nella LMC, c’è instabilità genomica Radiazioni->danno genetico NUCLEO Ciclo Cellulare Rb, p53 ABL Blocco in G1 inibizione della funzione di ABL a livello nucleare ?

Ph-chromosome translocation First event: Unknow genetic lesion Unstable Stem Cell Unstable Ph-positive Stem Cell Second event: Ph-chromosome translocation

Meccanismo d’azione del Gleevec (STI 571) Bcr-Abl Proteina Tir STI P ATP

Leucemia acuta a promielociti

PML-RARα NCor HD RAR PML

PML-RARα NCor HD ATRA RAR PML

Via estrinseca dell’apoptosi

Via intrinseca dell’apoptosi

Major apoptotic signalling pathways

Regolatori dell’apoptosi: Bcl-2 family

Proteine Bcl-2 come target molecolari resistenza ad apoptosi da CHT o RT e s. immune iperespressione Inibizione temporanea non tossica per cellule normali no up-regulation di altre proteine anti-apoptosi inibizione

Terapia target molecolare anti-Bcl2 Oligonucleotidi antisenso liposomiali (ASODN) linfoma non Hodgkin, leucemie acute refrattarie Molecole antagoniste e altri inibitori

Oligonucleotidi antisenso: meccanismo d’azione

ANTICORPI MONOCLONALI

Elementi da considerare per la costruzione di un Anticorpo Monoclonale 1. Scelta dell’antigene bersaglio 2. Immunogenicità dell’anticorpo 3. Durata della vita media di un anticorpo 4. Interazione tra anticorpo e funzioni effettrici del sistema immunitario del paziente 5. Coniugazione con tossine o radionuclidi

Murine variable regions Human constant regions Rituximab Murine variable regions CDR S S Hinge S S Human constant regions FcRI binding domain Carbohydrate Clq binding domain

Antibody-Drug Conjugates (ADCs) ADC are MAbs linked to cell-killing drugs High affinity and selectivity of Ab to tumor cells MAbs enter or are internalized within cells Cell factors or environment cause the drug to be released from the MAb Released drugs kills the cell Very specific cell killing. Much different than chemotherapy where all cells are exposed to drug.

Toxin X X Toxin Cancer cell expressing tumor antigen

Intracellular breakdown of Antibody linked toxin complex + Toxin

Calcichemicin intercalates into DNA