Biotecnologie ed Evoluzione della Terapia Medica dei Tumori Solidi Dr. Francesco Graziano Medical Oncology Hospital of Pesaro Biotecnologie ed Evoluzione della Terapia Medica dei Tumori Solidi European Commette for Genetic Cancer Research

della malattia metastatica Terapia dei tumori Stadio I-II Stadio III Stadio IV chirurgia chemioterapia primaria chemioterapia della malattia metastatica radioterapia chirurgia guarigione chirurgia prolungamento della sopravvivenza palliazione guarigione prolungamento della sopravvivenza

Riduzione della massa tumorale Obiettivi della chemioterapia antitumorale negli stadi avanzati (stadio IV) Aumento della sopravvivenza Beneficio sui sintomi

Sviluppo storico della chemioterapia antineoplastica 1945 Mecloretamina 1950 Metotrexato 6-Mercaptopurina Busulfan 1955 Clorambucil Ciclofosfamide 1960 Vinblastina, vincristina Fluorouracile, actinomicina D Melfalan 1965 Procarbazina, 6-tioguanina Citosina arabinoside Adriamicina Prima chemioterapia adiuvante con actinomicina D nel tumore di Wilms 1970 Bleomicina, dacarbazina da G. Bonadonna, 1999 (modificata)

Sviluppo storico della chemioterapia antineoplastica (II) 1975 CCNU, BCNU, cisplatino CMF adiuvante nel ca. mammario Terapia adiuvante nell’osteosarcoma Trapianto di midollo osseo PVB nei tumori del testicolo 1980 Etoposide, mitoxantrone Inizio chemioterapia primaria in vari tumori solidi resecabili 1985 Carboplatino Ifofosfamide + MESNA Trapianto autologo con GM-CSF Espansione chemioterapia primaria 1990 Paclitaxel, docetaxel Topotecan, irinotecan Gemcitabina Oxaliplatino Terapia antiemetica 1995 Target therapy 2000 da G. Bonadonna, 1999 (modificata)

Inibisce l’adenosina deaminasi Inibisce la biosintesi purinica pirimidinica PENTOSTATINA Inibisce l’adenosina deaminasi ACIDO FOSFONACETIL-L-ASPARTICO Inibisce la biosintesi purinica IDROXIUREA Inibisce la ribonucleotide reduttasi 6-MERCAPTOPURINA 6-TIOGUANINA Inibisce la biosintesi dell’anello purinico Inibiscono le intercorversioni nucleotidiche ribonucleotidi 5-FLUOROURACILE Inibisce la sintesi dell’acido timidilico CITARABINA FLUDARABINA 2-CLORODEOXIADENINOSINA Inibiscono la sintesi del DNA AGENTI ALCHILANTI MITOMICINA C CISPLATINO PROCARBAZINA DACARBAZINA Formano addotti con il DNA desossiribonucleotidi METOTREXATO Inibisce la riduzione dell’acido diidrofolico Blocca la sintesi purinica e dell’acido timidilico DNA BLEOMICINA ETOPOSIDE TENIPOSIDE Danneggiano il DNA e ne impediscono il riparo RNA (transfer, messaggero, ribosomiale) L-ASPARAGINASI Deamina l’asparagina Inibisce la sintesi proteica PACLITAXEL ALCALOIDI DELLA VINCA COLCHICINA Inibiscono le funzioni dei microtubuli DACTINOMICINA DAUNORUBICINA DOXORUBICINA MITOXANTRONE Si intercalano nel DNA Inibiscono la sintesi dell’RNA proteine enzimi (ecc.) microtubuli

Farmaci NON target! Tossicità arigenerativa dei chemioterapici antitumorali Amenorrea, azoospermia GONADI Alopecia CUTE ED ANNESSI CUTANEI Stomatite Enterite arigenerativa Colite mucosa-membranosa Diarrea MUCOSA GASTRO-INTESTINALE Leucopenia, immunodepressione, Piastrinopenia Anemia MIDOLLO OSSEO EMATOPOIETICO

A Paradigm Shift in the Treatment of Cancer Changing of the Guard A Paradigm Shift in the Treatment of Cancer Conventional cytotoxic drugs interact with DNA to prevent cell replication but are not specific to cancer cells We are moving to targeted therapies which specifically target cancer cells

Identificazione del bersaglio Target therapy: Identificazione del bersaglio Sopravvivenza e crescita delle cellula tumorale dipendono dal bersaglio

…. la comparsa degli “inib” e degli “umab” ...

Targeted Therapies Gli “umab Gli “inib” Monoclonal antibodies: proteine che si legano a recettore o altra molecola di segnale extracellulare Tyrosine Kinase Inhibitors: molecola che lega e inibisce attività enzimatiche intracellulari

Dalla biologia alla biotecnologia ai nuovi farmaci umab I umab Second messanger ……….inib I I Transcription Translation Proteolysis From JB Gibbs, 2000, modified

Lo sviluppo degli “umab” e degli “inib” segue quello dei chemioterapici antitumorali Acquisizione Screening Produzione e Formulazione Studi clinici di fase I Studi clinici di fase II Studi clinici di fase III Pratica medica

Valutazione farmacologico-clinica dei chemioterapici antitumorali (I) FASE I TOLLERABILITA’ Dose massima tollerata Tipo della tossicità limitante Schema di somministrazione ottimale Dose consigliata per la fase II FARMACOCINETICA FASE II ATTIVITA’ ANTITUMORALE Spettro di attività Relazione dose-risposta

Valutazione farmacologico-clinica dei chemioterapici antitumorali (II) FASE III-IV EFFICACIA TERAPEUTICA Valutazione comparativa con terapia standard Integrazione della chemioterapia nel trattamento primario Monitoraggio farmacocinetico TOLLERABILITA’ Farmacovigilanza

Drug Development Timeline 2-4 yrs 3-6 yrs

Farmaci a Berasglio Molecolare Anticorpi monoclonali ….gli “umab” Inibitori della trasduzione del segnale …” gli “inib” Rituximab (CD20) Imatinib mesilato ( bcr-abl -, c-kit-, PDGF-TKs) Trastuzumab (HER2) Gefitinib ( EGFR-TK) Erlotinib ( EGFR-TK) Cetuximab (EGFR) Bortezomib ( proteasoma) Sorafenib, Sunitinib Bevacizumab (VEGF)

Carcinoma Renale Here Lies Interferon Killed by Sunitinib & Sorafenib

The Von-Hippel Lindau Gene Located in the short arm of chromosome 3 Tumor suppressor function Found in up to 80% of sporadic (non-hereditary) renal cell cancers

Sporadic Renal Cell Cancer: VHL Two-Hit Hypothesis At birth First Hit Second Hit: Cancer

Inactivation of VHL: An Early Step in Kidney Carcinogenesis Loss of remaining VHL allele Mutation/s at non-VHL loci VHL (+/-) VHL (-/-): Cysts VHL (-/-): Tumor

Consequences of VHL Gene Mutation Elongin B/C Cul2 Rbx1 pVHL-E pVHL-A X Ubiquitin Ligase Complex Disrupted HIF HIF Accumulation VEGF, PDGF Glut-1, Erythropoietin TGF-, CXCR4 Angiogenesis Increased Metabolism Autocrine Growth Metastasis

Sunitinib Sunitinib ↑ VEGF ↑ PDGF VEGFR PDGFR ↑ VEGF Pericyte/Fibroblast/ Vascular Smooth Muscle Vascular Endothelial Cell ↑ PDGF Sunitinib Vascular permeability Cell survival, proliferation, migration Vascular formation, maturation Inhibition of RCC pathogenesis and progression

Horizontal “Targeted” Strategy pVHL HIF VEGF PDGF TGFa KDR PDGFR EGFR

TARGETs Single, Planned Progression-Free Survival* Analysis Proportion of patients progression free 0.25 0.50 0.75 1.00 Time from randomization (weeks) 6 12 18 24 36 48 60 66 Median PFS** Sorafenib = 24 weeks Placebo = 12 weeks Hazard ratio = 0.44 p-value <0.000001 54 Censored observation Placebo Sorafenib *Independently assessed **PFS analysis performed March, 2005 (data cut-off Jan 28, 2005) Escudier B et al. Oral presentation, ASCO, 2005

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor TK Extracellular Domain Transmembrane Domain Intracellular Domain

Human Epidermal Growth Factor Receptor Family No specific ligands - often acts as dimer partner NRG2 NRG3 Heregulins β-cellulin EGF, TGFa , b Cellulin Amphiregulin, HB-EGF Heregulins TK TK TK erbB1 HER1 EGFR erbB2 HER2 neu erbB3 HER3 erbB4 HER4

Epidermal Growth Factor Receptor Normal Cell Cancer Cell

EGFR expression in solid tumors EGFR is expressed in a variety of solid tumors Colorectal Colorectal cancer (advanced) 75-82% Lung cancer (NSCLC) 40-91% Head & neck cancer (SCCHN) 90-100% Gastric cancer 33-74% Ovarian cancer 35-70% Lung (NSCLC) Head & Neck (SCC)

Structure of the EGF receptor and its mechanism of activation HER2 HER3 HER4 Ligand (e.g. EGF, TGF) 1. receptor dimerization Extracellular domain Cell membrane Tyrosine kinase domain 2. tyrosine kinase domain activation ATP ATP P P transphosphorylation C-terminus domain P P Cytoplasmatic region P P phosphorylation of substrate tyrosines P P Inactive monomers From E. Raymond et al., 2000 (modified) signal transduction

EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA Una delle principali vie molecolari attivate dall’EGFR è quella di ras. Ras viene reclutata attraverso il legame con la molecola SOS.

EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA A sua volta, ras determina l’attivazione della serina/treonina chinasi raf, delle MAPKK 1 e 2 e delle MAPK ERK 1 e 2.

EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA Il risultato dell’attivazione di questa via molecolare è l’espressione di varie proteine nucleari, inclusa la ciclina D1 (necessaria per il passaggio G1-S nel ciclo cellulare).

EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA Un altro target di EGFR è il PI3K

EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA Il reclutamento di PI3K porta all’attivazione di Akt, una serina/treonina kinasi con forte attività antiapoptotica. N.B. la via di segnale di Akt svolge un ruolo nel determinare la chemioresistenza/ sensibilità della cellula neoplastica.

Targeting Cellular Signal Pathways umab inib Y EGFR Ras P P Raf MEKK PI3K Rho-B ERK sek Akt MAP kinase intermediates jnk/sapk C-myc C-jun Apoptosis N U C L E U S Ki-67

Anti-EGFR Cetuximab Panitumumab Anti EGFR antibody Mouse Chimeric Humanized Fully Human 100% Mouse 34% Mouse 10% Mouse 100% Human cetuximab matuzumab panitumumab

Colorectal cancer: cetuximab BOND Trial Cunningham et al. ASCO 2003 Randomized trial in 329/577 pts screened for EGFR+ tumors refractory to 5-FU/CPT-11 R CPT-11+cetuximab cetuximab

Cetuximab vs. CPT-11+Cetuximab in CPT-11 refractory CRC Patients free of progression (%) Patients surviving (%) Mono Combo N 111 218 No. events 92 152 Median 1.5 4.1 HR (95% CI): 0.54 (0.42; 0.71) log rank p-value < 0.0001 Mono Combo N 111 218 No. events 75 140 Median 6.9 8.6 HR (95% CI): 0.91 (0.68; 1.21) log rank p-value = 0.48

Monoclonal antibodies KRAS Mutations As an Independent Prognostic Factor in Patients With Advanced Colorectal Cancer Treated With Cetuximab Monoclonal antibodies R K K-ras mutato è sfavorevole

Anticorpi monoclonali Piccole molecole anti-TK Strategie anti-EGFR Anticorpi monoclonali TK TK Piccole molecole anti-TK PI3-K GRB2 pY pY SOS pY STAT3 RAS RAF PTEN AKT MEK Gene transcription MAPK G1 M S Proliferation/ maturation Survival (anti-apoptosis) G2 Chemotherapy / radiotherapy resistance Metastasis Angiogenesis

Gefitinib (piccola molecola anti-EGFR TK) Farmaco studiato nei carcinomi polmonari non a piccole cellule (esprimono EGFR) Small molecule TKIs R K

Differenze di risposta al gefitinib Group Response p value Study Women vs men 19% vs 3% 0.001 IDEAL 21 Japanese vs caucasian 27.5% vs 10.4% 0.0023 IDEAL 12 Adenocarcinoma vs others 13% vs 4% 0.046 Non-smokers vs former/current 36% vs 8% < 0.001 MSKCC3 1Fukuoka et al., JCO 2003; 2Kris et al., JAMA 2003; 3Miller et al., JCO 2004

Overexpression + mutation Normal Cell Cancer Cell

MUTAZIONI DI EGFR l’effetto delle mutazioni di EGFR sulla funzione della proteina è ancora oggetto di ricerca; le cellule che presentano forme mutanti di EGFR, vanno incontro a massiva apoptosi sotto l’azione di farmaci inibitori della via di segnale Akt e STAT-mediata.

85% circa di queste mutazioni MUTAZIONI DI EGFR 85% circa di queste mutazioni delezioni multinucleotidiche “in-frame” (ESONE 19) mutazioni puntiformi (ESONE 21)

> frequenza nel sesso femminile; MUTAZIONI DI EGFR > frequenza nel sesso femminile; > frequenza nelle popolazioni dell’est asiatico; > frequenza nei non fumatori; > frequenza nel tipo istologico adenocarcinoma.

2 classi differenti di molecole anti-EGFR Monoclonal antibodies Carcinoma del polmone (NSCLC) Carcinoma del colon Small molecule TKIs Monoclonal antibodies R R K K EGFR mutato è favorevole K-ras mutato è sfavorevole

Tossicità dei farmaci anti-EGFR Drug-related adverse events in >5% of patients: IDEAL 1 (250 mg/day) Tossicità dei farmaci anti-EGFR Patients (%) Rash Diarrhoea Pruritus Dry skin Acne Nausea No grade 4 drug-related adverse events were recorded Fukuoka et al 2003a

Adverse skin effects after gefitinib (ZD1839) treatment A. Mild (grade 1) acne-like rash in the breast area of a 52-year-old patient treated with 225 mg/d B. More severe (grade 2) facial acne-like rash in a patient treated with 1,000 mg/d for 8 months

Neo-angiogenesi tumorale Normal tissue Tumor tissue Jain: Science; 307: 58-62, 2005

formazione di nuovi vasi sanguigni a partire da pre-esistenti ANGIOGENESI: formazione di nuovi vasi sanguigni a partire da pre-esistenti vasi capillari normali aggressività della malattia esito clinico sfavorevole ridotta sopravvivenza globale

Il controllo dello switch angiogenetico dipende dall’equilibrio tra fattori PRO- ed ANTI-ANGIOGENETICI

è un fattore di sopravvivenza per le cellule dei vasi neoformati; VEGF è il più potente e specifico fattore mitogeno per le cellule endoteliali; è un fattore di sopravvivenza per le cellule dei vasi neoformati; induce un aumento della permeabilità vasale, facilitando l’immissione delle cellule neoplastiche nel torrente circolatorio.

Bevacizumab (Avastin™): rhuMAb VEGF Recombinant Humanized Monoclonal Antibody to VEGF 93% human, 7% murine Recognizes all isoforms of VEGF, Kd = 8 x 10-10 M Terminal half life 17-21 days

Bevacizumab (Avastin™): rhuMAb VEGF Somministrato e.v. insieme a chemioterapci Approvato per il trattamento dei pazienti con carcinoma del colon-retto avanzato

Bevacizumab + chemioterapia vs. Placebo + chemioterapia Sopravvivenza libera da progressione: IFL + placebo, 6,2 mesi; IFL + bevacizumab, 10,6 mesi (p<0,001) Risposta obiettiva: IFL + placebo, 34,8%; IFL + bevacizumab, 44,8% (p=0,004) Hurwitz e coll. New Engl J Med, 2004

GIST: Gastrointestinal Stromal Tumors GI sarcoma Highest incidence in the 40-60 year age group Expression of c-KIT (CD117) in ~95% of cases

Kit Receptor Phenotype ADP + P ATP Proliferation Survival Adhesion Invasion Metastasis Angiogenesis

Kit Receptor Phenotype ATP Imatinib Proliferation Survival Adhesion Invasion Metastasis Angiogenesis = imanitib contact point

Imatinib Mesylate (STI 571: Glivec) Formula: C30H35N7SO4 MW: 589.7 Inhibitor of selective tyrosine kinases bcr-abl PDGF-R c-kit Potent (IC50  0.1M)

PET Before and after Glivec for GIST 7/12/00 9/1/01

EORTC study: Imatinib for Advanced GIST Survival Benefit Verweij, et al 2004

c-Kit Receptor Structure Extracellular Domain (exon 9, 10.2%) Juxtamembrane Domain (exon 11, 66.1%) ATP Tyrosine Kinase Domain I (exon 13/14, 1.2%) Tyrosine Kinase Domain II (exon 17, 0.6%) = common mutation site

Overall Survival by Genotype Median Survival Exon 11 Not reached Exon 9 1347 days No mut 250 days Exon 11 Exon 11 Exon 9 No Mutation

Target therapy”? ….quale bersaglio?