Microchips nella diagnostica virologica Dott.ssa Francesca Torricelli Dott.ssa Sara Bernabini SOD Diagnostica Genetica Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi, Firenze 19 Novembre 2004

Progetto Genoma Umano È cresciuta l’attenzione nei confronti delle varianti genetiche Individuazione delle basi genetiche che regolano la predisposizione e la resistenza alle malattie Identificazione di nuovi geni malattia Sviluppo della Farmacogenetica Microbiologia Studi su larga scala Tecnologie rapide, economiche, automatizzabili

Variazioni nel genoma umano Substitutions Possono essere coinvolti uno o più nucleotidi Non tutte le variazioni hanno un effetto Se esiste un effetto, può essere di diverso genere Dipende dalla localizzazione e dalla natura della variazione MUTAZIONE: se la sua frequenza nella popolazione generale è 1% POLIMORFISMO: se la sua frequenza nella popolazione generale è  1% Ogni cambiamento nella sequenza del DNA

Variazioni nel genoma umano Confrontando il DNA genomico di due differenti individui il 99.9% risulta identico Le variazioni risiedono nel rimanente 0.1%

Single Nucleotide Polymorphism (SNP) È il più comune tipo di variazione genetica Cambiamento a livello di una singola base nella sequenza del DNA che si verifica nella popolazione con una frequenza superiore all’1% 1 SNP ogni 1.000 basi Il numero di SNPs associati ad un incremento del rischio per determinate patologie è in continuo aumento

Microarray Insieme ordinato di centinaia o migliaia di “informazioni genetiche” immobilizzate su un supporto che fornisce un substrato per l’ibridazione di campioni (appaiamento di due diversi filamenti di DNA secondo le regole della complementarietà)

Tecnologia Nanogen Metodica microarray che utilizza campi elettrici per il trasporto rapido e accurato delle molecole biologiche cariche ai siti testo del chip per incrementare l’efficienza delle reazioni di ibridazione (“ibridazione attiva”) Metodica microarray che utilizza campi elettrici Può essere utilizzata in molteplici campi applicativi ricerca biomedica farmacogenetica diagnostica microbiologia

NanoChip electtronico Each test site is electronically connected to the NanoChip system by a platinum wire. 100 siti testo (pad) localizzati nell’area centrale Array 10x10

NanoChip electtronico Pad (elettrodi) Connessioni elettroniche Ciascun pad presenta una connessione elettronica individuale con il sistema (Nanogen NanoChipTM Molecular Biology Workstation)

Ogni elemento del chip è indipendente dagli altri Campo elettrico L’array è costruito in modo tale che i diversi pad sulla sua superficie possano essere selettivamente caricati positivamente Ogni elemento del chip è indipendente dagli altri + + + DNA Il trasporto selettivo degli oligonucleotidi e dei prodotti di PCR viene effettuato applicando una carica positiva ai pad selezionati

Trasporto selettivo Nucleic Acids - +

Ogni pad rappresenta un elemento indipendente del chip Trasporto selettivo Ogni pad rappresenta un elemento indipendente del chip +

Trasporto selettivo La tecnologia Nanogen è estremamente accurata grazie al trasporto selettivo delle molecole biologiche in posizione specifiche dell’array e altamente versatile +

Sovrasta gli elettrodi Permeation layer Sovrasta gli elettrodi Funziona da matrice per l’attacco dei prodotti di PCR o degli oligonucleotidi biotinilati in quanto contiene streptoavidina Streptoavidina PCR o oligo Biotina Elettrodo di platino Permeation layer

Approcci possibili per lo studio di mutazioni/SNPs noti mediante tecnologia Nanogen Amplicon down Capture down

Amplicon down Deposizione elettronica dei prodotti PCR biotinilati e denaturazione Prodotti PCR biotinilati PCR target Biotina Cy3 Cy5 Oligonucleotidi reporter Ibridazione dei due reporter Stringenze termica e chimica Cy5

Temperatura di melting  30-35°C Disegno dei reporter Un reporter è specifico per l’allele wild-type, l’altro per l’allele mutato Disegnati in modo da avere la marcatura in 5’ e la mutazione/SNP in in posizione centrale Lunghezza 9-12 nts Temperatura di melting  30-35°C 5’ 3’ SNP Reporter wild-type Reporter mutato

Rappresentazione grafica dei segnali fluorescenti rilevati nei 100 pad Omozigote mutato Omozigote wt Eterozigote Sottrazione del background Pad nei quali è stato trasportato il buffer istidina 50 Mm in assenza del prodotto di PCR

Identificazione genotipica Wild-type (allele 1) 150 300 450 600 H17(Control) H61 H3 H49 Mutant (Allele 2) Homozygote Allele 1 Homozygote Allele 2 Heterozygote

Protocollo di studio Cartuccia vuota Micropiastra con Rivelazione & Analisi Reader Cartuccia vuota Micropiastra con campioni da analizzare Indirizzo degli amplificati Loader Cartuccia riempita: ibridazione This is a slide on our workflow (underlined steps are for slides following – we have slides for desalting, loader robotics, assay manager and patient report)

Potenzialita’approccio Amplicon down 1 SOLO PAD

Potenzialita’approccio amplicon down 1 SOLO PAD

SULLO STESSO CHIP 1372 CARATTERIZZAZIONI SEGNALI FLUORESCENTI DERIVANTI DALLO STUDIO DI 14 SNPs/MUTAZIONI IN CAMPIONI DIVERSI EFFETTUATO SULLO STESSO CHIP 1372 CARATTERIZZAZIONI Nonostante i numerosi step di ibridazione/stripping non è stato rilevato un incremento del background

Ottimizzazione del protocollo Permette una riduzione dei tempi analitici: 8h complessive per il trasporto di 1 solo prodotto PCR, 1 ibridazione e 98 caratterizzazioni 15h complessive per il trasporto di 7 prodotti PCR,14 ibridazioni/stripping e 1.372 caratterizzazioni Consente un abbattimento dei costi: da 9 Euro a 2-3 Euro per ciascun SNP/mutazione Rende la tecnologia ancora più indicata per studi su larga scala

Approcci possibili per lo studio di mutazioni/SNPs noti mediante tecnologia Nanogen Amplicon down Capture down

Capture down Deposizione elettronica di capture probes biotinilate Ibridazione elettronica del prodotto di PCR denaturato PCR target Deposizione elettronica di capture probes biotinilate Oligonucleotide capture Biotina Oligonucleotidi reporter Cy3 Cy5 Ibridazione passiva dei due reporter Stringenze termica e chimica Cy3

MICROBIOLOGIA Fino ad oggi la distinzione di generi e specie è stata effettuata in base a caratteri fenotipici Questi test sono caratterizzati da limiti: Non sono applicabili indifferentemente a qualunque specie batterica Vanno selezionati di volta in volta in base all’orientamento diagnostico Alcuni gruppi batterici esprimono pochi dei caratteri fenotipici normalmente utilizzati a scopo identificativo e sono quindi difficili da differenziare Non è possibile studiare il fenotipo di batteri non coltivabili

MICROBIOLOGIA I progressi nel campo della biologia molecolare hanno messo a disposizione una serie di tecniche (clonaggio, PCR, sonde di DNA etc.) che prescindono dalla coltivabilità del batterio Queste tecniche si sono rivelate capaci di genotipizzare le diverse specie batteriche, mediante l’utilizzo dell’RNA ribosomiale (rRNA) e dei suoi geni (rDNA) L’rDNA contiene regioni altamente conservate (funzionalmente importanti) ma anche sequenze variabili

Genotipizzazione di S. aureus C Pol389 G A Gyr875 Gyr802 Gyr744 Gyr661 Gyr547 Gyr541 Gyr484 Gyr301 Gyr61 Pol842 Pol809 Pol737 Pol644 Pol629 Pol371 Pol302 Pol92 Cy3TM Green Cy5TM Red   18 SNPs esaminati e caratterizzati attraverso l’uso di 36 sonde (reporter) marcate con Cy3TM or Cy5TM Approccio Amplicon down

Rivelazione degli agenti patogeni responsabili della meningite Sonde specifiche per l’identificazione dei batteri (marcate con Cy3) Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Sonde specifiche per l’identificazione dei virus (marcate con Cy5) HSV1 HSV2 VZV Approccio Amplicon down

Rivelazione degli agenti patogeni responsabili della meningite solo segnale verde  infezione batterica  ibridazione sequenziale con singole sonde batterio-specifiche solo segnale rosso  infezione virale  ibridazione sequenziale con singole sonde virus-specifiche segnale verde + rosso  ibridazione sequenziale con coppie di sonde batterio-specifiche/virus-specifiche Neisseria Streptococcus Haemophilus Gruppo 1 HSV1 HSV2 VZV Gruppo 2 Ibridazione contemporanea con miscela di sonde gruppo 1 + gruppo 2

Identificazione dei micobatteri Il genere Mycobacterium comprende oltre 100 specie ed il loro numero è in continuo aumento: in media tre nuove specie all’anno sono state descritte nell’ultimo decennio Tre sono indiscutibilmente patogene: Mycobacterium tuberculosis  responsabile della tubercolosi Mycobacterium leprae  agente eziologico della lebbra Mycobacterium ulcerans  responsabile di gravi ulcerazioni cutanee in molti paesi africani ed in Australia Le altre specie sono in larga misura opportuniste, capaci cioè di determinare patologie in concomitanza con abbassamenti delle difese dell’ospite Identificazione dei micobatteri per seguire terapie appropriate Specie diverse sono caratterizzate da diversa sensibilità ai farmaci

Amplicon down Deposizione elettronica dei prodotti PCR biotinilati e denaturazione Prodotti PCR biotinilati (16S rDNA: tratti comuni al genere Mycobacterium e tratti specie-specifici) PCR Biotina Ibridazione passiva dei due reporter Cy5 Cy3 Reporter specifico per il genere Mycobacterium Reporter specifico per la specie M. Tuberculosis Applicazione delle stringenze termica e chimica M. Tuberculosis Caso 1 Microrganismo che non è un micobatterio Caso 2 Micobatterio diverso dal M. Tuberculosis Caso 3

Capture down Deposizione elettronica delle diverse capture probe su differenti pad Capture probe biotinilate per l’identificazione del genere Mycobacterium e della specie M. Tuberculosis pad n°1 pad n°2 Ibridazione elettronica del prodotto di PCR denaturato pad n°1 pad n°2 Stesso prodotto di PCR denaturato Reporter specifico per il genere Mycobacterium Cy3 Reporter specifico per la specie M. Tuberculosis Cy5 Ibridazione passiva di una mix di reporter Applicazione delle stringenze termica e chimica pad n°1 pad n°2

Mycobacterium tuberculosis Comparsa e diffusione di ceppi resistenti ad uno o più farmaci Isoniazide Rifampicina Etambutanolo Streptomicina Pirazinamide Rifampicina: interferisce con i meccanismi di trascrizione dell’rRNA legandosi alla RNA polimerasi; la resistenza nel 97% dei casi è legata a mutazioni nel gene rpoB codificante per la subonitá  dell’RNA polimerasi Isoniazide: l’attivazione da profarmaco a principio attivo è mediata dall’enzima catalasi-perossidasi; il 60% dei ceppi resistenti presentano mutazioni nel gene katG codificante per la catalasi-perossidasi

Mycobacterium tuberculosis Valutazione della resistenza alla Rifampicina Le due piu’ frequenti mutazioni genetiche, responsabili di circa il 92% dei casi di resistenza, sono sostituzioni nucleotidiche che coinvolgono i codoni 526 e 531 e provocano una sostituzione aminoacidica nella proteina risultante Cambio nucleotidico Cambio aminoacidico nella subunita’  della RNA polimerasi La maggior parte delle mutazioni sono missense Pochi casi di inserzioni e delezioni

Metodica SNPmine Altro possibile utilizzo della tecnologia microarray elettronico Per la ricerca di tutte le possibili mutazioni/SNPs del target Mutazioni/SNPs note Mutazioni/SNPs non descritte in letteratura Screening di mutazioni geniche associate alla resistenza ai principali antibiotici utilizzati nella terapia antitubercolare

Metodica SNPmine Amplificazione delle sequenze wild-type (“campione reference”) relative ai geni di interesse: un primer biotinilato, un primer fluorocromato Cy3 Trasporto elettronico del campione reference + Biotina 1 pad/98 Cy3 Scansione del canale del verde per verificare l’addressing background Denaturazione (NaOH) per rimuovere l’elica non biotinilata

Metodica SNPmine Amplificazione dei campioni in esame (“campioni test”) : entrambi i primer fluorocromati Cy3 Trasporto elettronico del campione test denaturato (“ibridazione elettronica”) + Step di controllo: scansione del canale del verde Digestione del DNA a singola elica mediante esonucleasi Mung

Metodica SNPmine Caso 2: mismatch Caso 1: match Trattamento con la proteina MutS (mismatch binding protein) marcata con Cy5 Lavaggi e scansione Test mutato Test wild type

Metodica SNPmine L’applicazione della metodica SNPmine allo studio della resistenza ai farmaci da parte di M. tuberculosis permetterebbe di individuare rapidamente i ceppi eventualmente resistenti Permetterebbe di individuare il farmaco da non somministrare al paziente in esame poiché inefficace

Farmacogenetica E’ quella branca della ricerca genetica e della pratica clinica che si occupa delle differenze individuali nella risposta ai farmaci che sono dovute a variazioni genetiche Risposta ai farmaci Efficacia Tollerabilità Oggi di un farmaco si conoscono efficacia e tollerabilità nella media delle persone, ma non nel singolo individuo

Risposta ai farmaci Efficacia: raramente un farmaco ammesso in commercio, e quindi valutato come efficace in termini medi, lo e’ in piu’ del 60% dei pazienti Tollerabilita’: le reazioni avverse a farmaci sono la sesta causa di morte negli Stati Uniti; 2 milioni di ospedalizzazioni/anno e 100.000 decessi/anno in seguito ad effetti collaterali di farmaci correttamente prescritti

Farmacogenetica Nasce per l’esigenza di individuare, prima della somministrazione del farmaco, quali soggetti avranno una reazione favorevole e quali invece sono a rischio di effetti collaterali piu’ o meno gravi Obiettivo finale: mettere a disposizione test farmacogenetici capaci di predire a livello individuale se un paziente rispondera’ al farmaco e se questo gli potra’ causare un effetto collaterale, realizzando cosi’ la personalizzazione dell’approccio terapeutico

Risposta ai farmaci Soggetti diversi rispondono in modo diverso allo stesso farmaco Differenze di assorbimento Differenze di metabolismo Differenze di eliminazione Differenze di legame del farmaco con il bersaglio Tali differenze sono legate al grande numero di enzimi che intervengono nella risposta al farmaco: ogni enzima e’ prodotto da uno specifico gene  la maggior parte di questi geni sono polimorfici nella popolazione

Studio dei polimorfismi Pazienti senza efficacia nei trial clinici Pazienti con efficacia nei trial clinici Predittivo di NON efficacia Predittivo di efficacia DNA wild-type=ATCTGGATC Polimorfismo= ATGTGGATC

Test farmacogenetici: test predittivi Non saremo comunque in grado di fare una predizione assoluta, cioe’ dire con una sicurezza del 100% se il paziente rispondera’ (o non rispondera’) al farmaco, se avra’ (o non avra’) effetti collaterali E’ molto piu’ probabile che il risultato di un buon test farmacogenetico sara’ del tipo: il paziente ha una probabilita’ molto alta (ad esempio superiore all’80%) di rispondere bene al farmaco ed ha una probabilita’ molto bassa (ad esempio inferiore all’1%) di avere un effetto collaterale

Farmacogenetica e microchips Adatta a studi di farmacogenetica Versatilità Costi comparabili o minori a quelli delle tecniche “gold standard” Accuratezza Analisi su larga scala di mutazioni/SNPs Tecnologia Nanogen Adatta a studi di farmacogenetica

Microchips nella diagnostica virologica Dott.ssa Francesca Torricelli Dott.ssa Sara Bernabini SOD Diagnostica Genetica Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi, Firenze 19 Novembre 2004