Cromatografia su strato sottile Progetto “Lauree Scientifiche” Cromatografia su strato sottile - TLC -

CROMATOGRAFIA Progetto “Lauree Scientifiche” Nella cromatografia, le separazioni possono avvenire su colonna (colonna cromatografica) o su un supporto planare (TLC)

CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC) Progetto “Lauree Scientifiche” CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC) La cromatografia su strato sottile o TLC, è una tecnica cromatografica di semplice preparazione; questo la rende particolarmente adatta per l'esecuzione di valutazioni qualitative o semi-quantitative. Come tutte le cromatografie, si basa sulla diversa separazione di diverse sostanze tra una fase stazionaria ed una fase mobile, in funzione dell'affinità di ogni sostanza con esse.

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO Progetto “Lauree Scientifiche” PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO Tutti i componenti della miscela sono depositati sulla lastra (fase stazionaria) e sono trasportati (eluiti) da un solvente (fase mobile) che si muove. Nella TLC l’eluente si muove dal basso verso l’alto attraverso un strato sottile per capillarità. I composti si muovono con diversa velocità, in base alla diversa affinità della sostanza analizzata, verso un eluente e verso la fase stazionaria. Si ha separazione poiché i composti più affini all’eluente si muovono di più sulla lastra.

“Lauree Scientifiche” Progetto “Lauree Scientifiche” FASE STAZIONARIA La fase stazionaria è generalmente uno strato dallo spessore uniforme di circa 1 mm di materiale adsorbente, depositato su una lastra di vetro o plastica. Il materiale adsorbente può essere gel di silice, allumina, cellulosa in polvere o polvere di diatomee, tutti materiali polari

Fasi stazionarie (per TLC): Silice: la superficie dei granuli di silice è caratterizzata dalla presenza di gruppi silanolici (Si-OH) e di gruppi silossanici (Si-O-Si): Sistema tetraedrico di SiO4 Allumina: è ottenuta dall’idrossido di alluminio mediante opportuni trattamenti e disidratazione a 400-500°. Si può ottenere in tre forme:

“Lauree Scientifiche” Progetto “Lauree Scientifiche” FASE MOBILE La fase mobile è un solvente opportunamente scelto (od una miscela di solventi), capace di separare i componenti della miscela da analizzare e poco affine per polarità alla fase stazionaria scelta.

Esempio di serie di eluenti Con forza eluente crescente Su fase fissa polare n-pentano isoottano cicloesano di carbonio xilene toluene benzene cloroformio metilene cloruro tetraidrofurano acetone acetato di metile anilina n-propanolo etanolo metanolo acido acetico Fasi mobili (per TLC): La TLC utilizza un’ampia varietà di solventi, con diverso grado di polarità: potere eluotropo: forza con cui il solvente è in grado di trascinare l’analita lungo la lastrina; solventi apolari (idrocarburi alifatici quali esano o eptano) per soluti con polarità molto bassa; idrocarburi clorurati (CHCl3, CH2Cl2), tetraidrofurano, etere etilico, acetonitrile, alcool isopropilico: in ordine di polarità crescente

I vantaggi della tecnica TLC Progetto “Lauree Scientifiche” I vantaggi della tecnica TLC visibilità delle sostanze che rimangono sul punto di deposizione preparazione del campione spesso non necessaria utilizzo fasi mobili che assorbono in UV vasta scelta di reagenti chimici coloranti selettivi grande numero di campioni trattabili simultaneamente velocità di condizionamento

TECNICA CROMATOGRAFICA Progetto “Lauree Scientifiche” TECNICA CROMATOGRAFICA La traccia rossa è la sostanza più affine con l’eluente in quanto ha percorso un tragitto più lungo. La traccia gialla rappresenta una sostanza meno affine all’eluente,infatti ha percorso una distanza minore.

Separazione TLC di estratto di pomodoro Progetto “Lauree Scientifiche” Separazione TLC di estratto di pomodoro Analizzare un concentrato di pomodoro Estrarre sostanze principali: licopene e β-carotene Eseguire la tecnica cromatografica TLC Separare ed identificare componenti

Pigmenti nel concentrato di pomodoro: Progetto “Lauree Scientifiche” Pigmenti nel concentrato di pomodoro: LICOPENE: sostanza appartenente alla classe dei carotenoidi, è il principale responsabile del colore rosso del pomodoro e di altri pigmenti gialli e rossi caratteristici di alcuni frutti e verdure (albicocca, pompelmo, cocomero, uva). E’ presente nel sangue e in natura si trova sottoforma di isomeri strutturali di tipo trans e in particolare nella frutta e nella verdura fresca la percentuale risulta essere di 30mg/kg. Possiede un’altissima capacità antiossidante e antiradicali liberi, per questo viene utilizzato in molteplici applicazioni terapeutiche. Attualmente viene studiato per curare le malattie degenerative delle cellule.

“Lauree Scientifiche” Progetto “Lauree Scientifiche” β-Carotene: sostanza appartenente alla classe dei carotenoidi, determina il pigmento giallo-arancio di prodotti naturali, ad esempio della carota.

Descrizione dell’esperienza: Progetto “Lauree Scientifiche” Descrizione dell’esperienza: Materiale utilizzato: Bilancia tecnica Pipette graduate 2 becker, beuta, matraccio Cotone idrofilo Sostanze utilizzate: 50g pomodoro concentrato Diclorometano N-esano Alcool etilico 95% Sodio solfato anidro

“Lauree Scientifiche” Procedimento: Progetto “Lauree Scientifiche” Pesare nel becker 50g di concentrato di pomodoro e aggiungere 70ml di etanolo al 95% e agitare bene con la spatola; Mettere un po’ di cotone sul fondo di un imbuto e filtrare la miscela pressando leggermente Trasferire in becker la componente solida rimasta sul filtro; Trattare con 50ml di Diclorometano ed agitare per 5minuti; Filtrare in un imbuto munito di cotone e raccogliere il filtrato in una beuta. Si anidrifica con sodio solfato anidro. Portare a piccolo volume in pallone da 100ml in rotavapor e portare a secco.

SEMINA Progetto “Lauree Scientifiche” La semina viene effettuata con il nostro campione da analizzare,tramite un apparecchio chiamato microsiringa o con un semplice capillare per punto di fusione; questo procedimento deve essere fatto accuratamente

“Lauree Scientifiche” Progetto “Lauree Scientifiche” OSSERVAZIONI Il β-carotene è la componente che sale con maggiore velocità sulla lastra a causa della maggiore affinità con l’eluente. Il licopene invece viene rallentato perché instaura dei legami con la fase stazionaria che è il gel di silice. Licopene β-carotene Campione

“Lauree Scientifiche” Progetto “Lauree Scientifiche” ANALISI DATI L’analisi dei dati si basa su un fattore chiamato: Rf Rf= corsa della macchia /corsa dell’eluente Ogni sostanza ha un Rf diverso.

“Lauree Scientifiche” Progetto “Lauree Scientifiche” ANALISI A UV Qualora non sia possibile osservare direttamente le macchie di campione sulla superficie della lastrina - caso molto frequente - si può ricorrere all'osservazione sotto luce ultravioletta o alla reazione con reagenti che sviluppano composti colorati

“Lauree Scientifiche” Progetto “Lauree Scientifiche” CONCLUSIONI La tecnica TLC permette di separare i componenti principali di una miscela; le sostanze estratte sono pure, cioè molto simili agli standard. E’ possibile estrarre i componenti dal pomodoro.