Ruolo degli Agenti Demetilanti in Ematologia

Repressione della Trascrizione Metilazione del DNA e Repressione della Trascrizione Trascrizione attiva Repressione TF X POLII TF X CH3 CH3 CH3 C C C C C C MeCP DNA-non metilato DNA metilato

Metilazione nel genoma umano Le “CpG islands” : 200 bp-5000 bp. Si trovano principalmente nei promotori dei geni e negli introni. Sono normalmente non-metilate nei geni “house-keeping” Sono metilate nei geni tessuto-specifici. La demetilazione determina il differenziamento cellulare (es: geni del differenziamento mieloide, HbF) Herman et al, NEJM, 2003

X Silenziamento trascrizionale epigenetico TF siRNA Ipermetilazione DNMT1, 3a, 3b Ipermetilazione Rimodell DNMT Istone metilasi HDAC MBP TF C X CH3 Silenziamento genico

L’ ipermetilazione globale Costello et al, Nature Genetics, 2000 e’ frequente nelle LMA Costello et al, Nature Genetics, 2000

Ipermetilazione di geni oncosoppressori L’ipermetilazione contribuisce alla trasformazione e alla progressione neoplastica mediante l’inattivazione di geni oncosoppressori L’ ipermetilazione di diversi geni si trova gia’ nelle lesioni pre-cancerose del colon, indicando il possibile ruolo dell’ipermetilazione durante la iniziazione della tumorigenesi. Elevata frequenza di ipermetilazione anche nelle MDS. Analogamente al colon, le MDS rappresentano spesso la fase pre-neoplastica delle AML Il 68% delle t-MDS/t-AML presenta ipermetilazione di p15, che correla con la presenza di 7q-, allo stadio della t-MDS, e alla percentuale di blasti midollari (Christiansen, Leukemia 2003).

 U M “The Hallmarks of Cancer” Cancro Crescita autonoma Ridotta sensibilita’ ai segnali inibitori della proliferazione Blocco dell’ Apoptosi U Cancro M  Angiogenesi Angioinvasivita’ e Metastasi Replicazione Incontrollata

Geni ipermetilati in Ematologia Funzione Gene Mieloide Linfoide Ciclo cellulare p15, p16 (Inib-Kinasi-CD) MDS, AML, CML ALL, NHL, MM Trasduzione segnale RARb AML Estrogen receptor AML, CML Apoptosi P73 (p53-like) transcr.factor DAP-kinasi AML-MDS Contatto cell. Metastasi E-Caderina (Ca++/adesione cell.) CML (Cadherin-13), AML ALL, NHL (Cadherin-13), MM

Meccanismi di ipermetilazione nelle LMA Diretto: Iperespressione di DNMT1, 3a, 3b Mizuno et al, Blood 2001

Meccanismi di ipermetilazione nelle LMA Indiretti AML1/Eto lega HDAC e reprime la trascrizione (Amman et al, MCB 2001) Nella APL PML/RARa lega DNMT3a e interferisce con HDAC,bloccando l’espressione di geni “RAR-dependent” (Di Croce et al, Science 2002)

Geni importanti per la leucemogenesi, regolati dalla metilazione del promotore MGMT(O6-metilguanina-metiltransferasi): è un gene di riparazione del DNA che rimuove agenti alchilanti e citotossici dalla posizione 06 della guanina. DAP-chinasi: è una serin/treonina chinasi, regolata da calcio e calmodulina, con una funzione pro-apoptotica. GSTP1: e’ un gene di detossificazione. BRCA-1: e’ un gene di riparazione/ricombinazione del DNA, importante nel mantenimento dell’integrita’ genomica. E’ metilato nel 65% dei tumori ovarici e nel 10% di quelli mammari non-ereditari.

Methylation-Specific PCR (MSP) 100 bp DNA Ladder Unmethylated Methylated

Frequenza di ipermetilazione nelle LMA (n=150) 20 40 60 80 100 DAP- KINASI MGMT BRCA-1 GSTP1 Unmethylated Methylated

Ipermetilazione e leucemie therapy - related 13/17 Therapy Therapy - - 80 80 De novo De novo 60 60 50/100 15/30 40 40 7/25 40/154 18/111 4/25 20 20 4/111 BRCA - 1 GSTP - 1 DAP - K MGMT p= 0.06 p= 0.2 p= 0.01 P= 0.04 OR 2.8 (1.3-6.3) OR 5 (1.2-22)

Ipermetilazione e Prognosi T-MDS Overall Survival Christiansen et al, Leukemia 2003

Leucemia linfoblastica acuta Roman-Gomez-J, n=251 pts, Blood 2004

ALL DFS OS Roman-Gomez-J, n=251 pts, Blood 2004

MGMT e Prognosi: 84 pts con B-DLCL Esteller et al, JNCI 2001

Agenti demetilanti TF Trascrizione attiva DNMT1, 3a, 3b MBP Rimodell HDAC DNMT Demetilanti: Azacitidina, Decitabina, Pseudoisocitidina, 5-Fluorodeoxicitidina,Zebularina, Procainamide (?) Inibitori dell’ Istone Deacetilasi: Acido Valproico, sodio-fenil-butirato, Tricostatina,Depsipeptide TF CH3 CH3 CH3 C C C Trascrizione attiva

Meccanismo di azione dell’Azacitidina Herman et al, NEJM, 2003

Treatment of Jurkat cell line Azacitidina Decitabina 10 1 2 3 4 5 t=0 1 2 3 4 Dec 1μM Ac.Ac Ac.Ac Tc Tc Cells (106/ml) Aza 0,5μM Aza 1μM Days of culture

5 aza-2’-deoxicytidine Treatment Raji cell line Demethylation MSP DAP-Kinasi 200 nM DAC 1 μM DAC mock days 1 2 3 1 2 3 1 2 3 J - Unmethylated reaction Methylated reaction

5 aza-2’deoxicytidine Treatment Raji cell line Expression 200 nM DAC 1 μM DAC mock days 1 2 3 4 1 2 3 4 + - DAP-KINASE M GAPDH

Demethylation of DAP-KINASE and Apoptosis (HL-60 cells) 4.5% Day 0 4 8 12 Day 0 1 Tc Aza 1μM Ac.Ac % Day 4 2.3% 14% Ac.Ac Aza

5-azacytidine Treatment N= 191 pz with MDS 75 mg/m2 per 7 gg, ogni 28 gg At 4 months: Aza 60% response CR 7% PR 16% Improved 37% Supp. Care 5% improved N=37 pz no CR/PR Silverman et al, JCO 2002

Time to AML transformation or Death OS in relazione all’IPSS N=191 MDS pz OS in relazione all’IPSS Leucopenia grado 3-4: 59% Neutropenia: 81% Trombocitopenia 70% Infezioni 20% Nausea e vomito 4% Median Time to Progression Aza : 21 mesi Supp. Care: 12 mesi Silverman et al, JCO 2002

N=162 pz IPSS>Intermedio 1 Decitabine Treatment N=162 pz IPSS>Intermedio 1 PLTs dopo 1 ciclo PLTs stabili PLTs Van den Bosch et al, Leukemia 2004

Decitabine – Escalating doses N=48, 35 AML, 7 MDS, 5 CML, 1 ALL Non-hematological side-effects Issa et al, Blood 2004

Decitabine – Bu/Cy for BMT (N = 43 pz) Overall Survival Decitabine 400 mg/m2 600 800 Days -10 e -11 De Lima et al, Cancer 2003

Rischi della demetilazione Attivazione di proto-oncogeni Instabilita’ cromosomica Mutazioni Topi con ridotta DNMT1 presentano “ipometilazione” diffusa con ridotta stabilita’ genomica e presentano un’elevata incidenza di linfomi T (Gaudet et al, Science 2003) La sindrome ICF (immunodeficit, instabilita’ dei centromeri e anomalie faciali) e’ dovuta a una mutazione della DNMT3B e si caratterizza per una diffusa ipometilazione del DNA satellite. Incidenza di tumori non aumentata. La demetilazione farmacologica e’ transiente e reversibile entro 2 settimane (Yang AS, Science 2003)