Malattie da espansione di repeats instabili fenomeno scoperto nel 1991 (FraX, SBMA) inizialmente noto come “espansione di triplette” poi tetra- penta-nucleotidi: “repeats instabili” Caratteristica comune: fenomeno dell’anticipazione Effetto biologico: perdita di funzione della proteina guadagno di funzione (CAG) effetto tossico dell’mRNA

Malattie da espansione di repeats instabili: perdita della proteina Sindrome dell’X fragile E: CCGs del 5’UTR con iper-metilazione e silenziamento del gene. Proteina ricca in serine e proline, possibile fattore trascrizionale Atassia di Friedreich: GAAs nel primo introne con ridotta espressione e inibizione dell’elongazione. Proteina “fratassina” possibile trasporto del Ferro nei mitocondri con riduzione delle ferro-proteine.

Sindrome dell’ X fragile ripetizioni CGG nel 5’UTR 38 kb in Xq27.3 5 - 44 CGG con AGG ogni 9-10 triplette da 54 – 58 fino a 200 - 230 > 200

Sindrome dell’X fragile Caratteristiche cliniche ritardo mentale moderato nei maschi lieve nelle femmine altri segni macrocefalia, faccia allungata oriecchie sborgenti e basse lassità articolare macro-orchidismo Biologia molecolare 99% dei casi: CGG >200 1% dei casi: delezioni, mut puntiformi Prevalenza 16-25 su 100.000 maschi

Sindrome dell’ X fragile

Sindrome dell’ X fragile Maschi e femmine possono trasmettere la pre-mutazione Durante la meiosi materna la pre-mutazione può espandersi a “mutazione”

90 CGG 28-86 CGG 26-600 CGG

Sindrome dell’ X fragile: portatori di pre-mutazione (1:300) Sindrome FXTAS (maschi) progressiva atassia cerebellare e tremore intenzionale perdita della memoria a breve termine, declino cognitivo parkinsonismo, neuropatia periferica disfunzione autonomica debolezza muscolare dei cingoli (arti inf.) Penetranza: 17% a 60 aa 38% a 70 aa 47% a 80 aa 75% oltre gli 80 aa 2.2% delle atassie dell’età adulta 4.4% delle atassie ad esordio > 50 aa POF (femmine) - menopausa < 40aa nel 21% circa delle portatrici

Mutazioni dominanti effetto “tossico” dell’RNA messaggero Gene FMR1 CGG: 54-200 POF FXTAS CGG > 200 - FMR

Sindrome dell’ X fragile: Analisi in PCR Amplificazione della regione 5’UTR del gene FMR1

Sindrome dell’ X fragile: Analisi in PCR Maschio normale 29 CGGs Femmina normale 22-28 CGGs Femmina pre-M 29-58 CGGs Femmina pre-M 29-68 CGGs Femmina affetta 28 CGGs In caso di full-mutation, l’allele espanso NON è amplificabile

Sindrome dell’ X fragile: Analisi in Southern blotting EcoRI EagI 2.8 kb X attiva 5.2 kb X inattiva EcoRI EagI Allele pre-mutato > 2.8 kb X attiva > 5.2 kb X inattiva Allele mutato >> 5.2 kb EcoRI EagI

Endonucleasi di restrizione Enzimi che tagliano il DNA a doppia elica in siti specifici Blunt Ends = estremità prive di estensione

(soluzioni saline e/o calore) L’ ibridazione del DNA DNA a doppia elica DNA a singolo filamento Singolo filamento complementare denaturazione (soluzioni saline e/o calore) marcatura radioattiva o fluorescente SONDA

Southern Blotting (DNA)

Trasferimento di acidi nucleici su filtro , ibridizzazione e auto-radiografia.

Diagnosi mediante Southern blotting di delezioni genomiche digestione del DNA genomico separazione in gel di agarosio trasferimento su nitrocellulosa ibridazione con sonda di cDNA analisi dei frammenti riconosciuti dalla sonda Conclusione: il gene testato (X linked) è assente nel figlio maschio la madre ha solo una copia del gene (l’intensità delle bande è simile a quella della padre).

Perdita di un sito di restrizione -> banda di giunzione Diagnosi mediante Southern blotting di delezioni genomiche. Perdita di un sito di restrizione -> banda di giunzione sonda mut WT (eterozigote)

Sindrome dell’ X fragile: Analisi in Southern blotting

RITARDO MENTALE Ritardo mentale di varia entità colpisce il 3% della popolazione (si definiscono con R.M. pazienti con Q.I. inferiore a 70) le cause eziologiche sono identificate in meno del 50% dei casi cause esogene sono responsabili dal 18,6% al 44% dei casi di R.M. cause genetiche sono responsabili dal 17% al 47,1% dei casi di R.M. FRAX-A, FRX-E, anomalie cromosomiche queste variazioni nelle percentuali possono essere dovute: al grado di R.M. al criterio di selezione dei pazienti esaminati alla definizione delle diagnosi

Delezioni sub-telomeriche

Malattie da espansione di repeats instabili: guadagno di funzione Inclusioni citoplasmatiche , nucleari o entrambe .

Corea di Huntington Esordio : 35-44 anni (raramente infantile-senile) difetti di coordinazione motoria movimenti involontari coreici (arti, faccia, tronco) difficoltà nella programmazione delle attività depressione, irritabilità e demenza difficoltà nei movimenti volontari disartria e disfagia bradicinesia, rigidità e distonia tentativi di suicidio (28%) infezioni polmonari e urinarie, insufficienza cardiaca atrofia del caudato e putamen alla TC o RMN Esordio : 35-44 anni (raramente infantile-senile) Decorso : 10-20 anni (progressivo)

Gene HD 4p16.3 67 esoni – mRNA di 13654 basi – 3141 aa (350kD)

Trascritto gene HD 5’ UTR Esone 1 21 CAG (10-26) Esone 2 Esone 3…..

L’età di insorgenza correla con l’entità dell’espansione Le triplette CAG si espandono preferibilmente alla meiosi paterna Range Normale: 10-26 Intermedio: 27-35 Patologico: > 36

Proteina “Huntingtina” proteina espressa nei neuroni di diverse aree del SNC (citoplasmatica e nucleare) perdita di funzione della proteina mutata ? tossicità della proteina mutata ? proteolisi rilascio di un frammento N-term con poli-Glu formazione di aggregati citoplasmatici e nucleari sequestro di altre proteine e fattori di trascrizione prococe difetto del trasporto assonale segnale pro-apoptotico e morte cellulare

Malattie da espansione di repeats instabili: alterata funzione dell’RNA ….ed effetto biologico sconosciuto !

(1:8.000-10.000)

Il fenomeno dell’anticipazione nella distrofia miotonica Da una generazione all’altra l’età di insorgenza diminuisce e la gravità della malattia aumenta

correlazione tra fenotipo e lunghezza Distrofia Miotonica: correlazione tra fenotipo e lunghezza del CTG repeat

3’UTR introne 1