ENZIMI DI RESTRIZIONE

Reazione ligasica di frammenti di restrizione

Fig 4.20 separation of poly-A mRNA

mRNA Purification 1. Total RNA Purification 2. PolyA+ RNA purification using oligo(dT)

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 1 mRNA AAAAAn Anneal oligo dT primer primed mRNA AAAAAn TTTTT Reverse Transcriptase and dNTPs mRNA/cDNA hybrid AAAAAn TTTTT

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 2 mRNA/cDNA hybrid AAAAAn TTTTT RNase H AAAAAn nicked RNA TTTTT DNA Pol I nicked RNA used as primers by Pol AAAAA TTTTT

Gubler Hoffman cDNA Synthesis - 3 2nd strand cDNA in pieces AAAAA TTTTT E. coli DNA Ligase AAAAA ds cDNA TTTTT Clone into vector cDNA Library

cDNA synthesis TTTTTTTTT First strand Nick translation cDNA library

Vettori e clonaggio Vettori Plasmidi Fagi Cosmidi YAC

Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente Vettori e clonaggio Plasmide Molecola circolare di DNA a doppio filamento, normalmente presente nella cellula batterica, in grado di replicarsi autonomamente dal cromosoma.

VETTORI DI CLONAGGIO

Replicazione di un plasmide Vettori e clonaggio Replicazione di un plasmide

INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO IN UN VETTORE DI CLONAGGIO

CLONAGGIO: -TRASFORMAZIONE -SELEZIONE -CRESCITA COLONIE

BATTERICA DI INTERESSE IDENTIFICAZIONE DELLA COLONIA BATTERICA DI INTERESSE

Bromo-chloro-indoyl--galactopyranosidase or X-Gal (Clear) -galactosidase Bromo-chloro-indoyl (Deep blue insoluble) + galactose

Inserting chromosomal DNA into a vector Chromosome GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Vector GAATTC CTTAAG Cut with EcoRI and add DNA ligase Recombinant vector GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Ampicillin resistant; -galactosidase negative (White on X-Gal) LacZ gene codes for -galactosidase Ampicillin resistance gene

Bacteria from ligation plated on ampicillin and X-Gal Contains wild type plasmd Contains recombinant plasmd

Vettori e clonaggio

DNA clonabile in un plasmide: Vettori e clonaggio Lunghezza massima del DNA clonabile in un plasmide: circa 20 Kb

I virus sono piccoli parassiti non in grado di replicarsi. Vettori e clonaggio I virus sono piccoli parassiti non in grado di replicarsi. Dopo aver infettato una cellula-ospite utilizzano i suoi sistemi di replicazione e sintesi delle proteine per riprodursi

I batteriofagi (o fagi) sono virus che infettano i batteri. Vettori e clonaggio I batteriofagi (o fagi) sono virus che infettano i batteri.

Vettori e clonaggio Ciclo litico del fago T4

Il fago più utilizzato in biologia Vettori e clonaggio Il fago più utilizzato in biologia molecolare è il fago 

Vettori e clonaggio Ciclo litico e lisogenico del fago 

Vettori e clonaggio Assemblaggio di un fago 

Mappa del genoma del fago  Vettori e clonaggio Mappa del genoma del fago 

Vettori e clonaggio Clonaggio di frammenti di DNA nel fago 

Formazione di cloni fagici Vettori e clonaggio Formazione di cloni fagici

L’infezione dei batteri con il fago  è circa 103 volte più efficiente Vettori e clonaggio L’infezione dei batteri con il fago  è circa 103 volte più efficiente della trasformazione con un plasmide

Lunghezza del DNA clonabile in un fago: 20-25 Kb Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in un fago: 20-25 Kb

Un cosmide è un plasmide contenente la sequenza COS Vettori e clonaggio Un cosmide è un plasmide contenente la sequenza COS dal fago 

Vettori e clonaggio

Vettori e clonaggio Clonaggio di frammenti di DNA in un cosmide

clonabile in un cosmide: Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in un cosmide: circa 45 Kb

EcoR I Genomic Library Infect cells

AAAAAA cDNA synthesis cDNA library Infect cells

Genomic Library Construction Preparing the insert Partial digestion preferred

Ligation to vector

Genomic library cDNA library Source Variation Insert size Genomic DNA mRNA Source Species or strains Tissues Developmental stages Variation 12k -- 20k 0.2k -- 6k Insert size Equal Correlate with expression level Representation Only one Expression vs. non expression Type DNA DNA or antibody or protein Probe Gene structure Infer protein identity Encoded protein Purpose

Screening a eukaryotic gene library Homologous gene from other organism Mammalian genes are very similar Thus if trying to get human gene screen with the equivalent gene from another organism Oligonucleotide based on protein sequence or known sequence of homologous gene Purify protein and determine sequence Build a nucleotide sequence which codes for protein sequence

Amino acid sequence Met-Asn-Lys-Trp-Glu-Met Met = ATG; Asn = AAT or AAC; Lys = AAA or AAG; Trp = TGG; Glu = GAA or GAG How many probes must we make? ATG AAT AAA TGG GAA ATG ATG AAT AAA TGG GAG ATG ATG AAT AAG TGG GAA ATG ATG AAT AAG TGG GAG ATG ATG AAC AAA TGG GAA ATG ATG AAC AAA TGG GAG ATG ATG AAC AAG TGG GAA ATG ATG AAC AAG TGG GAG ATG

CLONAGGI MULTIPLI

VETTORI DI ESPRESSIONE

PROTEINE DI FUSIONE

PRODUZIONE DI LIBRERIE

Screening the Library ATTAGCGCCTTTACGCA ……………………TAATCGCGGAAATGCGT…………

Screening with DNA probe Probe is identified cloned From other organism Same organism Looking for variants Chromosome walk Chromosome walk

cDNA library Clone cDNAs Expression vector Screen for gene of interest based on activity or antibodies

Genome Projects Whole genome sequencing Fragment and clone Sequence ALL clones! Computer assembles

   Bee             Cat             Chicken             Cow             Dog             Fruit fly    Human    Malaria parasite    Microbial Genomes    Mosquito     Mouse    Nematode    Pig              Plant Genomes Central    Rat    Retroviruses     Sea urchin Tribolium            Sheep             Zebrafish Genome Projects Multiple organisms provide suitable systems for experimentation Zebrafish-development Rat-physiology Dog- genetic disease Fruit fly- behavior Some of practical significance Mosquito/Malaria parasite

(o metodo a terminazione di catena) Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) 1) Il sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento Per la sintesi del DNA si utilizzano DNA polimerasi caratterizzate da Elevata processività Bassa attività esonucleasica 5’-3’ Bassa attività esonucleasica 3’-5’ (es. Klenow, Sequenasi)

(1) Produzione dello stampo a filamento singolo Utilizzo di fagemidi Utilizzo della PCR Denaturazione del vettore Utilizzo di un fago helper Per M13 e produzione della Forma a singolo filamento

(o metodo a terminazione di catena) Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica ha bisogno di: 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S

(2,3) Sintesi del filamento marcato 5’-A T C T T T T A G A GT A C C 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ PRIMER DNA Polimerasi 5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ DNA Polimerasi PRIMER

(o metodo a terminazione di catena) Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad 1) Uno stampo a singola elica 2) un innesco specifico (primer) 3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S ha bisogno di: 4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

Terminazione della catena La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegue indefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotidi trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascuno 5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ DNA Polimerasi PRIMER + ddNTP ( per es. ddCTP) 5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*AT G T AddC STOP Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascuno in corrispondenza di ogni dCTP ddCTP

Schema di sequenziamento a terminazione di catena DNA stampo a singola elica 3’-GGCTAAC Ibridazione con Il primer 5’ 3’ 3’-GGCTAAC + [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP -CCG ddA -ddC -CC ddG -CCGA ddT -C ddC -CCGATT ddG -CCGAT ddT A C G T -CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC G T T A G C C Direzione di lettura Sequenza: 5’-CCGATTG

Nuovi metodi di sequenziamento Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica) Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimettrica) DNA stampo PCR con un solo primer ddATP ddA ddA ddA ddA ddA Vengono effettuate 4 rezioni di PCR, ognuna contiene un solo primer e uno dei 4 dideossi nucleotidi trifosfati. Si generano le consuete famiglie di filamenti a catena terminata che vengono risolti per elettroforesi su gel di poliacrilammide

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in solo pozzetto di gel ddA ddT ddC ddG

Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

Fluorescent DNA Sequencing A G T A C T G G G A T C Gel Electrophoresis

Detection of Fluorescently Tagged DNA DNA Fragments Separated by Electrophoresis Optical Detection System Scanning Laser Excites Fluorescent Dyes Output to Computer

Fluorescent DNA Sequencing Data

Fluorescent DNA Sequence Trace

Size of gene library N = ln(1-P) ln (1-A/B) N = Number of clones P = 95 % probability of finding gene A = Average size of DNA fragments B = Total size of genome E. coli has genome of 4,800,000 nucleotides Average size of insert is 10,000 nucleotides Number of clones for 95 % probability is 1700

Size of gene library If genome is large e.g. human genome (3 x 109) then number of clones to make library becomes unrealistic (1058000) if using a plasmid vector (accepts only 10 kb as larger DNA can’t be transformed) Therefore need to use vectors that can accept larger pieces of DNA I.e. if each vector contains a large piece of DNA you don’t need so many clones to make a gene library

What vectors for what libraries? Human library requires >1,000,000 plasmid clones Human library requires 14000 YAC clones

YAC=yeast artificial chromosome Vettori e clonaggio YAC=yeast artificial chromosome

Dimostrazione sperimentale degli elementi funzionali di un cromosoma Vettori e clonaggio Dimostrazione sperimentale degli elementi funzionali di un cromosoma

Vettori e clonaggio Vettore YAC: sequenze ARS CEN TEL

Vettori e clonaggio

Lunghezza del DNA clonabile in uno YAC: fino a 1000 Kb Vettori e clonaggio Lunghezza del DNA clonabile in uno YAC: fino a 1000 Kb

Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors Vettori e clonaggio Approximate Maximum Length of DNA That Can Be Cloned in Vectors Vector Type Cloned DNA (kb) Plasmid 20 λ phage 25 Cosmid 45 P1 phage 100 BAC (bacterial artificial chromosome) 300 YAC (yeast artificial chromosome) 1000

Whole Genome Shotgun Celera Genomics Fragment and sequence entire genome The entire genome is fragmented into small pieces, with no prior knowledge regarding the order or relationship of the clones to on another prior to sequencing. Assembly of these pieces is done by a computer, by searching for overlapping sequences. Each fragment is sequenced completely and then these pieces are aligned to one another by a computer, based on overlapping sequence between fragments.

Overview of Facts Asserted 2.91 billion base pairs (bp) 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s) less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins

Structure of the genome

http://genome.ucsc.edu

http://www.ncbi.nlm.nih.gov