Come una variazione locale di attività enzimatica influisce sul sistema? Aumentiamo un poco E 2. Cosa succederà a monte di E 2 ? S 1 scende, ma questo comporta: una diminuzione di v 2 e un aumento di v 1 v1 v2 v3 v4

Non è possibile prevedere intuitivamente la risposta del sistema (il nuovo ss) a motivo degli effetti incrociati. Esistono però dei vincoli tra le proprietà sistemiche (es. i C J ) in termini delle elasticità che possiamo derivare. Come? Similmente S 2 sale e questo comporta: una diminuzione di v 2 e un aumento di v 3 v1 v2 v3 v4

Coefficienti di risposta How can we describe the sensitivity of a steady-state variable to a perturbation of the local rate (activity) through a specific step caused by a change in a parameter that affects this step directly? Cambio il parametro x raggiungo un nuovo steady state il flusso passerà da J a J + δJ Although the parameter acted locally on step i, the change we observe is systemic in the sense that the properties of all steps in the system contributed to the observed change in the steady state.

Coefficiente di risposta Supponiamo che un enzima in una via metabolica sia sensibile ad un inibitore I. Quale sarà il cambiamento del flusso nella via quando aggiungo linibitore in vivo? Dipenderà da a) quanto è forte leffetto dellinibitore sullenzima b) quanto è forte il controllo del flusso da parte dellenzima (quanto vale il suo C J ) Posso descrivere leffetto di un qualsiasi composto attraverso lelasticità degli enzimi sensibili a quel composto e i corrispondenti C J

Come riformulare quantitativamente lanalisi di una via metabolica? Flusso nella via: J X 0 S 1 S 2 S 3 ….. X 1 E 1 E 2 E 3 E 4 … E n v 1 v 2 v 3 v 4 … v n Variabili: il flusso J, n metaboliti e (n+1) enzimi Possiamo ricavare il valore dei coefficienti di controllo (C J e C S )?

Quante incognite e quante equazioni? La via metabolica prevede: Il flusso, n metaboliti e (n+1) enzimi, le cui sono note (o conoscibili tramite esperimento) Come incognite ci sono: (n+1) C J e n(n+1) C S cioè n+1 + n(n+1) = (n+1) 2 Per ricavare il valore numerico dei coefficienti abbiamo bisogno di avere (n+1) 2 relazioni tra i coefficienti Sappiamo che esiste 1 equazione che lega i C J e n che legano i C S Mancano n 2 + n equazioni che ricaviamo dai teoremi della connettività

E possibile ottenere una piccola variazione nella concentrazione di un metabolita interno al sistema (es. δS 2 ), senza cambiare il flusso J o le concentrazioni degli altri metaboliti (es. S 1 )? RISPOSTA: è possibile se oltre al metabolita simultaneamente cambia anche qualche altro parametro (ad es. se lenzima E i aumenta della quantità dE i ), in modo da mantenere costante la velocità v i dellenzima in questione; la variazione di velocità sarà nulla e i due cambiamenti saranno legati come segue: Connettività per i metaboliti (C J )

Per la reazione 1 Per le reazioni 2 e 3 Normalmente questa ε vale 1 perchè la velocità di un enzima isolato aumenta dell1% se metto l1% in più di enzima La reazione 1 è influenzata non solo da S1 ma anche da S2 Che δe 1 abbia un effetto compensativo delleffetto di δs 2 on v 1 :

Although the system is in a new steady state (some parameters have changed), only the value of S 2 is different; J and S 1 are still the same.

S 1 non ha alcun effetto diretto sulla velocità di E 3, per cui il termine sarà nullo e lespressione è più semplice Teorema della Connettività (C J ) per il metabolita S 2 S 2 ha un effetto diretto sulla velocità di E 1 per cui Facendo lo stesso per S 1

Per ogni metabolita posso scrivere una relazione tra i C J in base al teorema della connettività n equazioni della connettività (C J ) (una per ogni metabolita) (a cui si aggiunge 1 teorema della somma per i C J ) sono sufficienti per risolvere il sistema di equazioni che coinvolgono i C J. In totale abbiamo quindi (n+1) relazioni che legano i C J Combining the summation theorems with the connectivity theorem, we are able to express the flux control coefficients in terms of the elasticities of the enzymes towards the internal metabolite concentrations. n 2 equazioni della connettività (C S ) (n per ogni metabolita) (a cui si aggiunge n teoremi della somma per i C S ) sono sufficienti per risolvere il sistema di equazioni che coinvolgono i C S

Per mezzo di ragionamenti analoghi è possibile derivare le relazioni tra i C S e le ε Teorema della connettività per i C S con ε S e C S definiti per lo stesso metabolita S (S j ). Teorema della connettività per i C S con ε S e C S definiti per metaboliti diversi Connettività per i C S Es., per S 2 nello schema della diap. 6

Sistemi semplici E un sistema di due equazioni in due incognite Somma C J connettività C J

Se considero anche i C S avrò ancora due equazioni in due incognite Essendoci 1 solo metabolita interno (S 1 ) non esistono altre relazioni della connettività dei C S Anche i C S possono essere definiti sulla base delle elasticità

Control coefficients in a three-step pathway ( v1 v2 v3 Esempi dei valori di un C J e di un C S

Posso risolvere il sistema!!! Esempi più complessi ma ancora semplici da risolvere manualmente: vedi via metabolica descritta in Cap. 10 di Fundamentals of Enzyme kinetics, di A. Cornish Bowden Vai a: Go to chapter 10 Fundamentals of enzyme kinetics ) Per sistemi complessi (con tanti enzimi, biforcazioni e substrate cycles), ci vuole lalgebra matriciale (vedere su questo Hofmeyr-Westerhof-Snoep, cap.2) …e se conosco le leggi cinetiche per gli enzimi e la concentrazione di S 1, allora posso ricavare il valore numerico delle elasticità e quindi il valore dei C J e dei C S

I coefficienti (del flusso e delle concentrazioni) dipendono anche dai valori dei parametri (X 0, X 1, quantità dei vari enzimi…). Se cambiano i parametri, automaticamente cambia lo ss e i valori * delle concentrazioni dei metaboliti * del flusso Cosa serve un modello? Nei modelli dinamici come quelli appena descritti, ricavo i valori di C J che suggeriscono i punti di intervento (metabolic engineering). Non è garantito il successo (il modello potrebbe essere sbagliato!) ma almeno posso fare predizioni da mettere alla prova …

Una raccomandazione: Abbiamo introdotto i concetti di Coefficiente di controllo 1) del flusso e 2) delle concentrazioni) Non torniamo indietro ad usare la vecchia nomenclatura del Rate Limiting Step! Alla domanda How much? (quanto un enzima influenza un flusso o una concentrazione) rispondiamo con un valore numerico (C J o C S ).

Referenze Per il concetto di CJ e di elasticità, vedi * Fell understanding the control of Metabolism, 1997 cap. 5; Vedi anche il cap. 10 di Fundamentals of Enzyme kinetics, di A. Cornish Bowden Go to chapter 10 Fundamentals of enzyme kinetics Go to chapter 10 Fundamentals of enzyme kinetics ( Per la dimostrazione dei teoremi si veda anche la ristampa dellarticolo originale: * Kacser, Burns, Fell (1995) The control of flux. Biochem. Soc. Trans. 23, * Jan-Hendrik S. Hofmeyr, Jacky L. Snoep, Hans V. Westerhoff Kinetics, Control and Regulation of Metabolic Systems, Pag (chapter 3: Metabolic Control Analysis) Tesi Teusink: Da leggere:

Possiamo così calcolarci per ogni enzima che sia sensibile a s J, quale debba essere il corrispondente cambiamento di concentrazione in E i (dE i ) per ottenere una v i costante (ammettiamo per semplicità che S J influisca solo sulla velocità degli enzimi E 2 ed E 3. Per una variazione in dS J a flusso costante, possiamo riscrivere il teorema della somma*: Più in generale Formulazione alternativa del teorema della connettività per i C J

S 2 affects the activities of the enzymes in the pathway (described by the elasticities), and these affect the flux (via the flux control coefficients). In the end, however, the total response of the system to a change in the concentration of S 2 should be zero