FERMENTAZIONI IN COLTURA SOLIDA (Solid State Fermentation - SSF) SSF (Solid State Fermentation): Processo fermentativo allestito impiegando materie prime solide, in condizioni di assenza o limitazione di acqua libera. TECNICHE ANTICAMENTE MESSE A PUNTO PER LA PRODUZIONE IN ORIENTE DI CIBI TRADIZIONALI E DI BEVANDE ALCOLICHE: Asia formaggio Egitto pane Cina salsa di soia la loro applicazione si è estesa anche alla produzione microbiologica di molecole ad attività biologica (antibiotici, enzimi) In relazione alle sue caratteristiche peculiari, si è quindi evoluto un nuovo tipo di applicazione biotecnologica delle SSF, soprattutto nell’ottica di utilizzo di residui agro-industriali e della prevenzione dell’inquinamento ambientale.

EVOLUZIONE STORICA DELLE SSF Le origini delle SSF risalgono all’antico Egitto. 1914 (Takamine): viene pubblicato per la prima volta un articolo che descrive la produzione di una enzima digestivo (Takadiastase) impiegando la coltura SSF con ceppi di Aspergillus oryzae cresciuti su crusca di grano Dopo la seconda guerra mondiale: vengono costruiti i primi impianti per SSF che prevedono un sistema di aerazione forzata. 1960: si verifica una morìa di tacchini per ingestione di farina di arachidi contaminata da aflatossina prodotta da Aspergillus flavus. Ricerche condotte in tale ambito evidenziano che questa tossina viene sintetizzata in elevate quantità solo se la fermentazione viene allestita in SSF, non in coltura sommersa. Le prime fermentazioni SSF su larga scala sono state sviluppate per la produzione di enzimi e di acido citrico.

ESEMPI DI FERMENTAZIONI IN COLTURA SOLIDA CON SUBSTRATI NATURALI PRODOTTO CEPPO SUBSTRATO -amilasi A. oryzae, Rhizopus sp., Bacillus sp. Crusca di grano, manioca -galattosidasi Kluyveromyces lactis Crusca di grano o di mais Proteasi Penicillium caseicolum Crusca di grano e latte scremato in polvere Rennina Mucor pusillus, M. miehei Crusca di grano Etanolo S. cerevisiae Mais, carrube, polpa di frutti Acido lattico Lactobacillus sp. Rhizopus oryzae Sorgo + glucosio Tetraciclina Streptomyces viridifaciens Patate dolci Sake A. oryzae, A. kawachii Riso, malto Salsa di soia Aspergillus sojae Farina di soia

CARATTERISTICHE DELLE SSF 1. L’ambiente di coltura è statico, generalmente non sottoposto ad agitazione 2. L’impiego di acqua è limitato. generazione di quantità minori di effluenti liquidi 3. Il volume della coltura è inferiore rispetto ad una coltura sommersa, in quanto il substrato non è disperso in acqua ma è solido 4. I substrati impiegati per le SSF sono generalmente naturali (cereali, vegetali, residui agricoli …). 5. I MO impiegati nelle SSF sono generalmente ifomiceti, in grado di sintetizzare amilasi e cellulasi, che idrolizzano l’amido e la cellulosa e penetrano nel substrato solido.

SSF vs SmF (COLTURA SOMMERSA) vantaggi e svantaggi delle SSF Le SSF, in particolar modo i processi condotti a ridotta concentrazione di umidità, sono relativamente resistenti alle contaminazioni batteriche; E’ possibile condurre fermentazioni con una concentrazione di substrato molto più elevata rispetto alla coltura sommersa (il contenuto di umidità del substrato è inferiore); Le SSF richiedono generalmente costi di esercizio inferiori rispetto ai processi allestiti in coltura sommersa (minore controllo dei parametri di fermentazione); Se è necessario estrarre il prodotto, la quantità di solvente da impiegare e i costi di estrazione sono inferiori (downstream semplice); Il trattamento dei residui di fermentazione è semplice: dopo essiccamento, possono essere impiegati nell’alimentazione zootecnica o come fertilizzante; Le SSF richiedono sistemi di aerazione più facilmente gestibili rispetto alle fermentazioni allestite in coltura sommersa; Le SSF non presentano problemi relativi alla formazione di schiuma; L’inoculo nelle SSF avviene tramite conidiospore. Esse possono essere conservate per lunghi periodi.

SSF vs COLTURA SOMMERSA SVANTAGGI: Lo sviluppo di calore può essere limitante per il processo fermentativo; La coltura non è omogenea, e il processo fermentativo è difficilmente controllabile; La valutazione dello sviluppo microbico mediante tecniche dirette è difficoltoso, è necessario impiegare tecniche indirette; Le condizioni di SSF non sono adatte per lo sviluppo di tutti i MO: muffe e funghi possono svilupparsi in ambienti a ridotto contenuto di umidità, i batteri raramente; Il controllo del pH nel corso della fermentazione è di difficile gestione; Il pretrattamento dei substrati può essere costoso La conoscenza degli aspetti ingegneristici e di sviluppo/modellazione di processo è ancora limitata.

SUBSTRATI IMPIEGABILI Piante coltivate: manioca soia barbabietola o canna da zucchero patate sorgo Residui di piante coltivate: crusca e paglia di frumento e riso residui di barbabietola e canna Residui dell’industria del caffè: polpa e bucce Residui di frutti: tritume di mele e uva (pomace) scarti di ananas e banana Residui di produzione di oli: cocco arachidi palma

ALLESTIMENTO DI UNA FERMENTAZIONE SSF La preparazione del substrato solido e l’inoculo della coltura sono due step fondamentali: le condizioni iniziali di fermentazione influenzano fortemente l’andamento dell’intero processo. PREPARAZIONE DEGLI INGREDIENTI: Il substrato solido viene sempre sottoposto a pre-trattamenti prima dell’inoculo: Macinazione per aumentare la superficie a contatto con il microrganismo 2. Trattamento con vapore, che produce un incremento del contenuto di umidità sulla superficie (quantità di acqua impiegata: 10-15% in peso del substrato iniziale). Se il substrato è in polvere, si può miscelare direttamente con acqua 3. Trattamento termico ad elevate temperature per circa 1 ora a pressione atmosferica (cottura) Si ottiene la sterilizzazione del substrato solido e la gelatinizzazione dell’amido, che in questo forma risulta più attaccabile dalle amilasi microbiche.

INOCULO DELLA COLTURA: A fine cottura, il substrato solido viene portato alla T di inoculo. L’inoculo può essere costituito da una coltura pura o da colture miste (muffe, lieviti e batteri). Nei processi che prevedono l’impiego di ingredienti contenenti amido, si inoculano generalmente anche ceppi di Mucor sp. e Rhizopus sp., che hanno un’attività amilasica molto intensa (superiore rispetto ai ceppi di Aspergillus). Inoculo: 1-5 x 105 spore/g substrato impiegato L’inoculo (in forma gassosa o liquida) avviene disperdendo le spore sulla superficie del substrato solido, che viene agitato ad intervalli regolari per rendere omogenea la coltura. Chicco di riso con sviluppo dell’ifomicete Tempeh: Preparato da semi di soia su cui vengono fatti sviluppare ceppi di Rhizopus oligosporus

VALUTAZIONE DELLO SVILUPPO MICROBICO Lo sviluppo microbico è un parametro importante di controllo dell’andamento del processo fermentativo. Nel caso delle SSF, il micelio penetra nel substrato ed è quindi difficilmente separabile. Non è quindi possibile impiegare metodi diretti di valutazione. Per questo motivo vengono impiegati metodi indiretti, che prevedono la determinazione di: - DNA - proteine - chitina (costituente della parete) - N-acetil glucosammina (costituente della chitina) Anche l’analisi dei gas in uscita dalle SSF è una procedura in grado di fornire una valutazione indiretta dello sviluppo microbico: SOUR (Specific Oxygen Uptake Rate) descrive la quantità di O2 impiegata dal microrganismo per consumare 1 g di substrato

FERMENTATORI I bioreattori messi a punto per condurre le SSF assolvono a due compiti: contenimento controllo dell’ambiente Prevenzione della contaminazione da organismi ambientali e viceversa Controllo della temperatura Durante lo sviluppo microbico viene prodotto calore in quantità considerevole Mantenimento delle condizioni ottimali di processo Le parti solide non disperdono calore in maniera efficiente La temperatura nelle SSF spesso aumenta a livelli incompatibili con lo sviluppo microbico

Rapporto elevato superficie volume Scala di laboratorio Scale-up Trasferimento spontaneo di calore inadeguato Presenza di meccanismi di aerazione forzata Inconveniente: perdita di umidità per evaporazione La limitazione del contenuto di acqua libera può provocare il blocco dello sviluppo microbico E’ necessario un sistema di controllo del livello di umidità Possibili soluzioni: spray di acqua impiego di aria umidificata

VASSOI Rappresentano il tipo di reattore generalmente e tradizionalmente più impiegato. Prodotti tradizionali: tempeh Prodotti “moderni”: antibiotici ed enzimi Nei sistemi più datati, i vassoi, di legno, plastica o metallo, spesso forati sul fondo, venivano mantenuti in camere a T controllata. La coltura non viene agitata, oppure agitata manualmente ad intervalli regolari aria CO2, acqua Max. 4 cm Vantaggi: semplicità di uso Svantaggi: scale-up difficoltoso (un numero elevato di vassoi rende non economico e troppo laborioso l’intero processo fermentativo).

Tempeh

FERMENTATORI A VASSOI L’evoluzione dei sistemi a vassoi ha consentito di mettere a punto i fermentatori a vassoi. La fermentazione viene condotta in appositi reattori in condizioni stazionarie, senza agitazione meccanica, a T e umidità controllate. L’altezza massima dello strato solido può raggiungere i 15 cm, ma uno spessore inferiore migliora il controllo della T. Sono stati messi a punto sistemi in continuo: caricamento del substrato sterilizzazione raffreddamento inoculo microrganismo essiccamento macinazione confezionamento

Prophyta 

Filamentous fungi suitable for solid-state fermentation: Coniothyrium minitans, Paecilomyces lilacinus, Verticillium lecanii, Talaromyces flavus, Metarhizium anisopliae, Beauveria spp., Trichoderma spp., Gliocladium spp., Ophiostoma sp., Monascus sp., Sepedonium sp., Penicillium spp., Sclerotinia spp., Fusarium spp., Claviceps purpurea, Pseudocercosporella sp., Pleurotus sp., Basidiomycetes

PACKED BED REACTOR I bioreattori packed bed dispongono di un sistema di aerazione forzata (flusso ascendente). Esistono reattori a sviluppo verticale o orizzontale. La differenza di T (fino a 10°C) tra il fondo e la superficie del substrato (ad esempio riso) dipende dallo spessore della coltura (da 10-20 cm a 1,5 m) e dall’aerazione. Spesso la camera non è termostatata. L’aria satura di umidità viene fornita dal basso e attraversa il letto, con flusso intermittente (regolazione on/off) in funzione della T segnalata da un sensore.

Packed-bed reactor (continua) Un altro tipo di reattore packed-bed orizzontale prevede, al suo interno, una vite senza fine che mescola la coltura ad intervalli.

Limitano il surriscaldamento Packed bed verticali Di forma cilindrica, possono contenere anche lastre verticali che corrono lungo tutta l’altezza, in cui circola acqua fredda Limitano il surriscaldamento Nel corso del processo fermentativo, lo sviluppo microbico avviene sulla superficie del substrato, e lentamente si propaga verso gli spazi vuoti che si creano all’interno della coltura Diminuisce lo spazio disponibile per la circolazione dell’aria attraverso la coltura (fino all’1% rispetto al valore iniziale) L’incremento della P tra ingresso e uscita dell’aria può essere impiegata come misura online dello sviluppo microbico.

FERMENTATORI A TAMBURO ROTANTE Esistono due tipi di reattori a tamburo: 1. Tamburo rotante Il reattore è costituito da un grosso cilindro, posto in orizzontale, che ruota ad intervalli regolari. Il tamburo può essere dotato di frangiflutti per migliorare il mescolamento prodotto dalla rotazione. 2-3 rpm 2. Tamburo ad agitazione orizzontale Il corpo del reattore non si muove, L’azione di mescolamento è fornita da un sistema di agitazione a pale presente all’interno L’aerazione è forzata e fornita nella fase di rotazione del tamburo, al fine di massimizzare il contatto tra substrato e aria fresca. rapida rimozione di calore rapido rifornimento ossigeno

La miscelazione ottimale si ottiene quando il reattore è riempito per il 30% dell’intero volume. Impiegato anche per la produzione di glucoamilasi da Rhizopus japonicus: il substrato è costituito da residui della lavorazione di patate.

FLUIDIZED-BED REACTOR In questo tipo di bioreattore, il substrato viene mantenuto in movimento tramite un potente flusso di aria dal basso. INCONVENIENTE: spesso la coltura tende ad aderire alle pareti del fermentatore. Questo tipo di coltura offre alcuni vantaggi: la superficie effettiva del substrato in cui avviene lo sviluppo del micelio è maggiore rispetto ai reattori packed bed, in cui lo sviluppo avviene prevalentemente in superficie; il letto del substrato viene mantenuto in condizioni omogenee; il rifornimento di acqua, nutriliti, acidi e/o basi è facilmente gestibile; la rimozione della CO2 e del calore è facilitata.

COMPARAZIONE TRA LE DIVERSE PROCEDURE DI FERMENTAZIONE: Un agitatore, posizionato nella parte bassa, serve a rompere gli agglomerati più pesanti, che tendono a depositarsi sul fondo del reattore. KIKKOMAN CORPORATION (1975) air-solid fluidized bed reactor 8000 L Produzione di enzimi da Aspergillus sojae su crusca COMPARAZIONE TRA LE DIVERSE PROCEDURE DI FERMENTAZIONE: Produzione di enzimi da Aspergillus oryzae ENZIMA SOMMERSA (U/ml) SOLIDO STAZIONARIO (U/g solidi) FLUIDIZED BED Proteasi neutre 5.5 x 102 3.4 x 103 2.3 x 104 Proteasi acide 11 2.6 x 102 3.7 x 102 -amilasi 6.4 x 102 1.9 x 104 5.8 x 104

Strumentazione standard per il controllo delle SSF Sistema di rilevamento della Temperatura Il raffreddamento può avvenire secondo tre meccanismi: Conduzione: raffreddando le pareti del reattore Convezione: forzando l’ingresso di aria fredda secca Evaporazione: forzando l’ingresso di aria umida - Sistemi di rilevamento dell’umidità della coltura: non sempre applicabili dell’aria mediante sensori elettrochimici Sistema di analisi dei gas in uscita (Off-gas analysis) Misurazione della CO2 e dell’O2 Fondamentale per verificare lo stato fisiologico della coltura

Submerged fermentation SSF Plafractor (mix) www.biocon.com

Impianto costituito da una serie di vassoi impilati Plafractor: Impianto costituito da una serie di vassoi impilati Struttura simile ad un bioreattore per coltura sommersa Produzione di statine, molecole ad attività anticolesterolemica, da ceppi di Aspergillus