Adriana Maggi METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI

GENERAZIONE DI ANIMALI REPORTER Ingegneria Animale animali mutati geneticamente ad esprimere un gene reporter

METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Iniezione di DNA esogeno nella cellula uovo (TRANSGENESI STANDARD) Ingegneria di cellule staminali in coltura e loro iniezione in blastocisti (GENE TARGETING)

TRANSGENESI STANDARD GENE TARGETING Microiniezione del DNA clonato Trasfezione del DNA clonato in cellule ES zigote Embrione stadio 2 cellule Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti Impianto della blastocisti in femmina pseudogravida Impianto nella femmina pseudogravida Topo chimerico 10-20% dei nascituri contiene il transgene Ibrido F1 25-75% della progenie portano il transgene

Preparazione costrutti Screening della progenie ‘pseudo pregnant’ Preparazione oociti fecondati microiniezione Preparazione costrutti Screening della progenie

Preparazione oociti fecondati Cocktail ormonale Incrocio Recupero uova fecondate

Preparazione del costrutto Purificazione del transgene propagazione del transgene transgene Vettore di clonaggio

Preparazione delle ‘pseudo pregnant’ Maschio vasectomizzato Femmina Incrocio Impianto degli oociti microiniettati

Microiniezione e reimpianto degli oociti microiniettati Prelievo delle uova fecondate Microiniezione Trasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di femmina pseudogravida

Screening della progenie Analisi del DNA estratto dalle code della progenie per : Southern blot PCR

GENE TARGETING - procedura - generazione di cellule staminali (Embryonic Stem cells o cellule ES) preparazione del vettore trasfezione delle cellule ES con il vettore iniezione delle cellule trasfettate nella blastocisti generazione di topi mosaico incroci successivi per ottenere l’animale con il transgene nella linea germinale

Generazione di cellule staminali ES Femmine dopo 3-4 giorni dal concepimento Blastocisti Espianto e messa in coltura Crescita in terreno selettivo per le ES Disaggregazione 1 passaggio Linea pura

Trasfezione delle ES Trasfezione del vettore (elettroporazione) Selezione delle cellule knock out Cellule ES

Strategia di selezione delle ES knock out Destino del DNA Integrazione sito specifica Integrazione random Frequenza: Omologa/non omologa = 1/1000

Iniezione delle cellule ES nella blastocisti - generazione di animali mosaico -

Incroci per l’omozigosi Founder/wild type F1/F1 Omozigoti 1:4 Eterozigoti 1:2 Wild type 1:4 F2

THROUGH INTRACELLULAR REPORTER SYSTEMS TO STUDY DRUGS ACTIVE THROUGH INTRACELLULAR RECEPTORS GFP POL II, TF, co-regulators ER Reporter ERE transcription Reporter: easily detectable protein REPORTER MOUSE

The ERE-Luc reporter mouse: a model to study of ER transcriptional activity INSULATOR ( MAR ) light luciferin + ATP = oxyluciferin + AMP + TK ERE 2x firefly luciferase +/- ERE-Luc reporter mouse ERE kinase-dependent activation Ciana et al., 2001

5 min. after the acquisition Evaluation of ER transcriptional activity 20 min. i.p. of D-luciferin 5 min. after the acquisition

dpc (day post conception) ERE-Luc mouse 18.5 16.5 14.5 13.5 15.5 dpc (day post conception) ER is transcriptionally active at day 14.5 pc

ERE-Luc mouse GP Rando, 2007 P1 18.5 16.5 14.5 13.5 12.5 dpc (day post conception) post-natal day 1 endoderm mesoderm ectoderm imaging IHC A B C D E F G H C – intestine 20x D – bone 40x E – heart 40x F – forebrain 10x G – moustache 40x H – skin 20x 16.5 dpc GP Rando, 2007

ERE-Luc mouse Luciferase activity in adult, cycling females M D P E bone 2 4 6 thymus 1 3 brain 5 10 15 20 P E M D2 intestine 8 12 16 LUCIFERASE ACTIVITY (RLU) D liver ovaries uterus 7 9 hypothalamus Luciferase activity in adult, cycling females M D P E /ml) 50 S ESTRUS pg 5 ( 40 4 E2 (pg/ml) 3 30 Estradiol 20 2 10 10 day 1 M day 2 D day3 P day 4 E Ciana et al, Nature Ned., 2003

ERE-Luc mice to understand ER involvement in mammals physiopathology Pregnancy & Embryo Development 13.5 14.5 15.5 16.5 17.5 18.5 19.5 12.5 DAY 18.5 DAY 16.5 DAY 13.5 DAY 14.5 DAY 15.5 DAY 1 DAY 10 Immature Mice Adult Mice LIFE CYCLE Suckling Mice

MOLECULAR IMAGING IN LIVING SMALL ANIMALS Functional Magnetic Nuclear Resonance MicroPET Positron emission tomography Nuclear imaging Micro SPECT single-photon emission computerized tomography Optical imaging Bioluminescence Functional MRI: Pentylenetetrazol (PTZ) induced epileptic seizures were imaged with BOLD-sensitive gradient echo MRI (TE=20 ms). Multiple cortical areas, hippocampal, thalamic, and midbrain nuclei show different temporal changes in signal intensity. Top row: four images of the resting state prior to the injection. Middle row: putative kindling preceding seizure. Bottom row: full blown seizure. Image courtesy of Bruker Medical and C. Ferris, K.Lahti, D. Olson, & J. King. Psychiat. Dept, Univ. Massachusetts, Worcester, Mass. USA microCT - Mouse Skeleton Full skeleton of mouse body, lateral view. Image courtesy of ImTek, Inc. microPET: Species: Rat Type of Study: Whole Body Tracer: 18F-FDG Injected Dose: 2 mCi Imaging Time: 8 mins / bed position, 16 positions Comment: Whole body sections through rat showing 18F-FDG distribution. Notice prominent uptake in heart, brain and collection of FDG in the bladder. MicroSpect: Animation of a normal mouse scan Fluorescence: Skeletal metastases in mouse. Image courtesy of AntiCancer, Inc. Ultrasound:Sagittal section of whole mouse embryo. Image courtesy of VisualSonics Inc. and Foster and Zhang, Sunnybrook and Women's College. Ultrasound Fluorescence 2/06

IN PHARMACOLOGICAL RESEARCH! PARTICULARLY, IN PHARMACOLOGICAL RESEARCH! ONE PICTURE IS WORTH TEN THOUSAND WORDS (Frederic Barnhard 1927) 2/06