Biotecnologie Farmacologiche e Basi molecolari dell’azione del farmaco AA 2010/11 Lezione 19 Adriana Maggi

FARMACI BIOLOGICI Per la Comunità Europea, un composto o un farmaco biologico è definito come: “una sostanza che è prodotta o estratta da una sorgente biologica che richiede per la sua caratterizzazione e controllo di qualità una combinazione di analisi fisiche-chimiche e biologiche, insieme al processo di produzione e suoi controlli” (Dir. 2003/63/EC, part I, Section 3.2.1 (b)).

FARMACI BIOTECNOLOGICI Farmaci biologici prodotti da cellule procariote o eucariote opportunamente modificate per opera di ingegneria genetica

Considerando l’origine da organismi viventi sono da considerare come composti/farmaci biologici molti antibiotici, ormoni, enzimi, immunoglobuline, emoderivati… e tutti i farmaci prodotti grazie a tecnologie di ingegneria genetica: IL MINIMO COMUNE DENOMINATORE DI TUTTI QUESTI COMPOSTI E’ LA COMPLESSITA’ STRUTTURALE

Prodotti biotecnologici I biofarmaci hanno dimensioni e struttura molto più complesse dei prodotti chimici Prodotti biotecnologici Prodotti di sintesi Interferone beta: peso molecolare: 19000 Da Aspirina peso molecolare: 180 Da

Proteine terapeutiche - Svantaggi nuove metodologie di produzione riproducibilità nella produzione purificazione della macromolecola di sintesi contaminanti nella purificazione stabilità del prodotto finito vie di somministrazione e farmacocinetica

Proteine terapeutiche – Vantaggi Generalmente esercitano una attività estremamente mirata e specifica Data la loro specificità hanno limitati effetti collaterali indesiderati Data la loro alta specificità ed essendo di origine umana sono generalmente ben tollerati Possono sopperire a un difetto genetico – nuovi bersagli terapeutici Il tempo di approvazione da parte delle autorità regolatorie è significativamente inferiore a quello di molecole di sintesi (1 anno per 33 proteine/ 294 piccole molecole approvate tra 1980 e 2002 ) La protezione brevettuale può essere più lunga di altri composti per le difficoltà di ottenere prodotti biosimilari

Proteine terapeutiche di I e II generazione Proteine di I generazione identiche alle proteine endogene umane Proteine di II generazione modificate al fine di: Migliorarne le caratteristiche farmacocinetica (diminuire la biodegradabilità, aumentare la penetrazione cellulare, ecc) Generare prodotti innovativi con funzioni diverse da quelle originarie Generare dei prodotti più stabili facilitandone la conservazione

Proteine di II generazione TNFa (Fattore di Necrosi Tumorale) una citochina che gioca un ruolo chiave nel danno infiammatorio in malattie autoimmuni o nella malattia di Crohn La prima di queste, l’ Etanercept (Enbrel), è una proteina di fusione dal peso molecolare di 150 kDa tra la forma solubile del recettore per il TNFalfa umano e la porzione Fc delle immunoglobuline umane IgG. Farmaci con funzione analoghe sono l’Infliximab (Remicade), un anticorpo monoclonale “chimerico” cioè in parte umano (frammento Fc umano) e in parte di derivazione murina (domini della catena variabile VK e VH) Adalimumab (HUMIRA) sviluppato molto recentemente che consta di un anticorpo interamente umanizzato.

MODIFICAZIONI SECONDARIE CHE CAMBINO IL PROFILO DI IDROFOBICITÀ Possono migliorare il legame con proteine di trasporto plasmatiche di trasporto e quindi la residenza nel circolo: Insulina detemir della Novo Nordisk), interferone alfa, peptide GLP1, desmopressina (legame di acidi grassi a residui attivi sulla superficie della proteina)

AGGIUNTA DI POLIETILENGLICOLE (PEG) PER AUMENTARE LE DIMENSIONI DELLA PROTEINA E RIDURNE IL METABOLISMO E CLEARENCE RENALE

Analoghi del GH : Pegvisomant Analogo ricombinante di hGH - lys 120 sostituita con una gly previene la dimerizzazione funzionale del recettore qualsiasi aminoacido tranne lys o ala in questa posizione: Promotore della crescita Þ antagonista GH - Pegilazione – coniugazione via i gruppi aminici a 4 - 6 catene di polietilen-glicole Aumento di T1/2 (SC) a circa 6 giorni Picco plasmatico 33 - 77 ore Ridotta immunogenicità la pegilazione maschera i determinanti antigenici Ridotta affinità di legame altri otto aminoacidi sostituiti

La complessità strutturale dei biofarmaci richiede una complessità nella produzione Biologics are manufactured using living systems and cell cultures. Biological molecules are inherently variable. They are sensitive to light, temperature, and other environmental conditions. Precisely controlling the manufacturing process is necessary to obtain consistent results.

Produzione di proteine terapeutiche Processi diversi danno luogo a prodotti non identici tra loro FINE Il prodotto finale è il risultato di numerose scelte La scelta del downstream processing La scelta della sequenza genica INIZIO Typical Protein Production Process La scelta del vettore La scelta delle condizioni di fermentazione La scelta dell’organismo per la produzione

Difficoltà nella produzione di biofarmaci Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di espressione del transgene. Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamento nell’impianto pilota Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks. Controllo delle condizioni di produzione Recupero e produzione Caratterizzazione del prodotto CONTROLLO QUALITA’

Difficoltà nella produzione di biofarmaci Controllo di qualità di proteine terapeutiche Caratterizzazione della proteina Determinazione dello stato di purezza Saggio biologico SDS PAGE/Western Saggio immunologico HPLC SDS PAGE Western Presenza di proteine seriche Isoelectrofocusing Presenza di proteine cellulari HPLC Presenza pirogeni Mappa peptidica Presenza di DNA cellulare Sequenziamento N-terminale Spettrometria di massa Composizione in carboidrati Composizione in acido sialico

Microeterogeneità di proteine terapeutiche collegate alla biologia del prodotto o al processo produttivo process related, undesired modifications of side chains (e.g.,carbamylation, citraconylation) artifical, desired modification (e.g. pegylation) process related, undesired modifications of amino acids (e.g., oxidation, deamidation pyroglutamate formation) biologic, desired modifications (e.g., glycosylation, phosphorylation, sulfatation, acylation) biologic, undesired modifications (e.g., methylation, acetylation, formylation, proteolysis) process related, undesired modifications of the tertiary and quaternary structure (e.g., partial denaturation, aggregation)

L’esempio del : t-PA (527 amino-acid protein; 17 S-S bridges; 3 glycosylation sites) Eterogeneità determinate per via sperimentale Variability in N-linked carbohydrate side chains Oxidation of Cys or Met residues Deamidation of Asn residues Additional O-Glycosylation Proteolysis at Arg-X Single-chain and two-chain forms N-terminal sequence length variation NH2 COOH Total possible variants: 1.09 x 109 References available

Spesso i farmaci biotecnologici sono costituiti da una miscela di isoforme Isoelectric Focusing: glycosylated product is subfraction of cell culture isoforms In-vivo Bioactivity Cell Culture Pure Bulk 14 13 12 11 10

Eritropoietina sintetizzata da diversi laboratori Different biophysical characteristics when compared to the innovator product (Eprex®) Source: Schellekens H, EJHP, 3/2004, Scientific Section, pp 43-47.

Cosa sappiamo delle risposte cliniche a “piccole” variazioni nelle molecole sintetizzate da diversi laboratori?

Experience from Innovators and manufacturing process changes Tissue Plasminogen Activator (tPA) - Genentech Roller bottle to a fed batch process (new cell line, new downstream processing and new formulation) Analytics showed different carbohydrate structures; clinical studies showed impact on PK and efficacy This led to a delay in clinical development whilst differences were further investigated Lenercept - Genentech Scaled-up the manufacturing process that led to less sialylation of the protein In clinical studies, this was shown to impact the PK and increase the immunogenicity The project was terminated Raptiva - Genentech Scaled-up the process before conducting phase 3 clinical studies and found small analytical differences No differences in nonclinical PK. In clinical studies AUC had increased by 30% and efficacy had decreased Phase 3 study repeated Eprex  – J&J Formulation change; no analytical differences observed Resulted in >180 cases of pure red cell aplasia (PRCA) in renal failure patients (175/191 Eprex) SC route of administration contraindication; further drug product changes; 20,000 patient registry

Due farmaci con meccanismo d’azione apparentemente identico Adalimumab e Infliximab : legame selettivo con il TNFa e conseguente blocco della interazione con i recettori del TNF, p55 e p75 Etanercept: inibizione competitiva del legame del TNF ai recettori di superficie, che previene le risposte cellulari mediate dal TNF rendendo il TNF biologicamente inattivo

Due farmaci con meccanismo d’azione apparentemente identico Apparente maggiore efficacia di moAb anti-TNF vs Etanercept Ma risposta clinica a Etanercept in alcuni casi non-responsivi a Infliximab Blocco TNFa e b vs a solo Dosaggi diversi? Effetto biologico diverso? (efficacia in m. granulomatose, i.e. Crohn)

Biosimilari in quanto sono simili, non identici, ai prodotti originali copiati EMEA Guidelines “It is not expected that the quality attributes … will be identical” “Minor differences in the active substance, such as variability in post-translational modifications may be acceptable, however, must be justified” “there may be subtle differences between biosimilars” These differences can have clinical implications eg. different efficacy or safety

Perchè biosimilare e non generico Biosimilar, Follow-on Biologic, Follow-on Protein, Subsequent Entry Biologic ……. Prodotto biologico che vuole essere assimilabile a un prodotto biologici innovativo il cui brevetto è scaduto. Tuttavia, la produzione del biosimilare Avviene da parte di ditte diverse dalla Ditta originaria detentrice del brevetto Richiede un nuovo orgaismo per la produzione, un nuovo processo produttivo, nuovi metodi analistici I primi biosimilari: Omnitrope® (somatropin) in Australia, EU e USA Valtropin® (somatropin) in EU NON esistono prodotti-copia in Asia e in S. America

Leggi e regolamenti L’European Medicines Agency (EMEA) nel 2004 ha elaborato una serie di direttive per l’approvazione di farmaci biosimilari : i primi tre farmaci biosimilari approvati in Europa sono stati: Ormone della crescita Eritropoietina Granulocyte-colony stimulating factor Nell’ottobre 2010 i funzionari EMEA hanno iniziato a prendere in considerazione la legislazione per l’immissione sul mercato di anticorpi monoclonali (mercato globale 36,4 miliardi di US$): nel 2013 scade il brevetto del Rituximab (mercato globale 5,6 milioni di US$)

European Medicines Agency scientific guidelines for biosimilars TITLE MAIN MESSAGES Guideline on Similar Biological Medicinal Products Generic standards do not apply Minor difference acceptable, but must be justified Direct comparisons limited to drug product Greater differences require more clinical data Guideline on Similar Biological Medicinal Products Containing Biotechnology-Derived Proteins as Active Substance: Quality Issues Similar efficacy Similar safety Similar immunogenic potential Guideline on Similar Biological Medicinal Products Containing Biotechnology-Derived Proteins as Active Substance: Nonclinical & Clinical Issues First, is the broad framework. This provides an ‘umbrella’ guideline on the approach to bringing products to market Quality Guidelines: This indicates that biosimilar manufacturers need to identify a reference product and conduct tests to ascertain similarity. The EMEA accepts that differences in products are intrinsic to the manufacturing process. Non-Clinical & Clinical – There is an expectation that clinical data will be provided to demonstrate similarity or equivalence to the reference product in most situations. Non-clinical data will not suffice. This is a relatively high threshold, which in most cases necessitates clinical studies. On the issue of multiple indications biosimilars will need to demonstrate efficacy for each indication unless there is proven to be the same mechanism of action, or an alternative strong scientific basis. This means that there will not be automatic approval for multiple indications. The guidance also states that data on immunogenicity will need to be generated before approval. Annexes – noted that they are product specific and that draft comments are due in October 2005. Class-specific nonclinical and clinical requirements Study designs, post-marketing commitments etc. Recombinant Human Erythropoietin Recombinant Human G-CSF Recombinant Human Insulin Recombinant Human Growth Hormone

Normal MAA vs. biosimilar MAA CMC Nonclinical Clinical Drug substance Manufacture Characterisation Control Reference standard Container Stability Drug product Description Development Comparability data Analytical comparison with reference product Pharmacology Primary pharm. Secondary pharm. Safety pharm. Interactions Pharmacokinetics ADME Toxicology Single dose Repeat dose Genotoxicity Carcinogenicity Reproduction Local tolerance Pharmacology Pharmacokinetics Single dose Repeat dose Special populations Efficacy and safety Dose finding Schedule finding Pivotal Indication 1 Indication 2 Indication 3 Indication 4 Post-marketing studies Safety in larger population Efficacy in other indications Immunogenicity

Biosimilar EPO guideline Preclinical studies Comparative non-clinical studies 28-day toxicology Human PK & PD studies Single dose in healthy volunteers using SC and IV Include PD evaluation (reticulocytes) in PK studies Efficacy studies 2 x studies (vs. innovator) in renal anaemia (6-month) SC and IV Dose and Hb as primary endpoints Extrapolation Yes – equivalence in renal anaemia may allow extension to other indications, if justified by applicant Safety Safety from efficacy studies is adequate Plus, 12-month, comparative immunogenicity data Post-Approval Commitments Rare serious AEs, including pure red cell aplasia (PRCA) Safety in cohort of patients from all indications (ie. including extrapolated indications)

Biosimilar G-CSF guideline Preclinical studies Comparative non-clinical studies 28-day toxicology Human PK & PD studies Single dose in healthy volunteers using SC and IV ANC and CD34+ in healthy volunteers Efficacy studies 2-arm (vs. innovator) OR 3-arm (vs. innovator + placebo) equivalence trial in chemo-induced neutropenia (CIN) OR PD study in healthy volunteers (if justified) Extrapolation Yes – Equivalence in CIN will allow extrapolation to other indications, if mechanism of action is the same Safety Evaluate AE’s and immunogenicity in CIN study Include a 6-month follow-up Post-Approval Commitments Immunogenicity and rare serious AEs, particularly in chronic indication Lack of efficacy in extrapolated indications

Practical experience from EU regulatory framework Omnitrope® (somatropin) 2 Reference product: Genotropin (Pfizer) Alpheon® (interferon alfa-2a) 3 Reference product: Roferon-A (Roche) 57% of patients developed antibodies to Omnitrope in the first study Problem was residual host-cell protein Re-developed purification process Conducted a second phase 3 study Antibody levels reduced Lower quality Not as pure as Roferon-A Lower efficacy than Roferon-A More patients relapsed Safety profile worse than Roferon-A More side-effects European Medicines Agency Review European Medicines Agency Review APPROVED REJECTED In these cases, clinically meaningful differences could not be excluded without clinical studies evaluating efficacy and safety

Biosimilar views outside the EU

Omnitrope® (somatropin) - Sandoz Different opinions in different regions Australia United States Genotropin Children; GHD Adults; GHD Turner syndrome Prader-Willi syndrome Omnitrope Children; GHD Turner syndrome Growth disturbance; renal insufficiency Genotropin Children; GHD Adults; GHD Prader-Willi syndrome Children small for gestational age Omnitrope Children; GHD Adults; GHD Europe Omnitrope Clinical Programme Phase 1 (PK/PD) 3 studies in healthy volunteers; n = 60 Phase 3 1 study in children with GHD; n = 89 Post- approval commitments (EU) Safety in children small for gestational age Safety in children with Prader-Willi syndrome Occurrence of malignancy Occurrence & impact of anti-GH antibodies Genotropin Children; GHD Adults; GHD Turner syndrome Prader-Willi syndrome Children small for gestational age Growth disturbance renal insufficiency Omnitrope Children; GHD Adults; GHD Turner syndrome Prader-Willi syndrome Children small for gestational age Growth disturbance; renal insufficiency

United States Legal and Regulatory Status Legal basis for approval Food, Drug & Cosmetics Act (FDCA) Public Health Service Act (PHSA) Several provisions for abbreviated approvals eg. Hatch-Waxman for drugs Biologics are specifically excluded 505(b)2 offers a pathway for FDCA proteins eg. Omnitrope Majority of biologics approved under this act PHSA does not have provisions for abbreviated approvals Congress discussing legislative pathway now (proposed legislation under debate) FDA has published a “white paper” 4 and testified at Congressional hearings Science allows a legal and regulatory pathway to be established Generics principles cannot be applied Data exclusivity provisions for innovators (proposals range from 0 to 14+ years)

Outstanding issues

Issues still being addressed in Europe Interchangeability (ie. automatic substitution) Should or can we adopt the same “automatic substitution” principles that we have in place for small-molecule generics? Generic principles are based on the active substance being identical – biosimilars will be similar, not identical Pharmacovigilance & Traceability “to support pharmacovigilance monitoring, the specific medicinal product given to the patient should be clearly identified” 1 Decisions/guidance on how this will work in practice still pending Prescribing Information What information should be provided to healthcare providers and patients – should we follow the generic model? Transparency seems to be ultimate direction ie. not generic model eg. clinical data for approval, advice on substitution Non-proprietary Names On-going debate at international level Questions centre on role of INN in clinical practice ie. prescribing/dispensing and pharmacovigilance WHO decision expected in late 2007

Substitution / Interchangeability EMEA have provided guidance on interchangeability In fact Lonngren stated explicitly: It is not possible we would guarantee a biosimilar is interchangeable (with its originator). We make this guarantee with generics, but with two identical molecules we can say these molecules will behave in an identical way. This has never been a regulatory decision…the decision is based on clinical experience that you could switch one drug but you could not switch another because patients reacted in different ways. Member states starting to address question at national level For example: France has just passed a law preventing interchangeability for biologics Other EU Member States are addressing this question now

Pharmacovigilance systems should cope with biosimilar introduction This is not an issue unique to biosimilars ….. existing issue that is highlighted and exaggerated by their arrival Eprex®  Biosimilar EPO  (1)  Biosimilar EPO  (2)  Adverse Event Ensure traceability Company and Regulatory Agency AE reporting systems should distinguish one manufacturers product from another Complex, if biosimilars have the same INN as the innovator AE reports are often incomplete eg. lot number Repeated, uncontrolled substitution will confound accurate pharmacovigilance Occasional changes are inevitable or necessary in chronic therapy Prevent repeated, uncontrolled substitution

Labelling Summary of product characteristics - different to reference product 4.4 Special warnings and precautions Advice to healthcare providers on substitution: “Changes from {Brand X} to another {common name} preparation should be done under medical supervision” 4.8 Undesirable effects Unique data from biosimilar product could be included Number of patients, indications & data Cross-reference to reference product 5.1 Pharmacological properties Define basis for approval as a biosimilar & identify the reference product Define which indications are based on data and those that are extrapolated

Naming Same or similar International Nonproprietary Name (INN)? New products = New name New chemical or biological entities For example: Filgrastim, lenograstim & nartograstim Atorvastatin, simvastatin Identical = Identical name Small-molecule generics For example: Atorvastatin, simvastatin Similar = Similar name? Biosimilars No provision under World Health Organisation (WHO) criteria “The aim of the INN system … is important for the clear identification, safe prescription and dispensing of medicines to patients, and for communication and exchange of information among health professionals and scientists worldwide.”

Conclusioni

Conclusioni Biosimilari sono una nuova classe di prodotti medicinali Non sono generici come inteso per le piccole molecole di sintesi L’ EMEA ha stabilito ottimi standard per l’approvazione Una serie di importanti domande deve trovare una risposta solo dopo l’approvazione Rimangono punti di discussione che riguardano l’introduzione dei biosimilari nella pratica clinica Regole per la sostituibilità automatica Farmacovigilanza Labelling Scelta del nome La comunità medica deve avere la piena consapevolezza delle problematiche legate all’uso di biosimilari

References EMEA guidelines for similar biological medicinal products. Available at http://www.emea.europa.eu/htms/human/humanguidelines/multidiscipline.htm European Public Assessment Report (scientific assessment) for Omnitrope. http://www.emea.europa.eu/humandocs/Humans/EPAR/omnitrope/omnitrope.htm European Medicines Agency Questions and Answers on recommendation for refusal of marketing application for Alpheon. http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/opinion/19089606en.pdf The FDA’s assessment of follow-on protein products: a historical perspective Nature Reviews Drug Discovery, published online 13 April 2007; doi:10.1038/nrd2307 http://www.nature.com/nrd/journal/vaop/ncurrent/pdf/nrd2307.pdf

FARMACI INTELLIGENTI (TARGETED THERAPY)

…..ogni terapia, per definizione, ha un bersaglio.

forse ad oggi non abbiamo ancora compreso tutti i bersagli esatti da colpire, purtroppo i nostri pazienti soffrono ancora per questa mancanza… George W. Sledge, Jr; J Clin Oncol, 2005

il bersaglio è ben definito Initiating event inflammation ECM remodeling angiogenesis lynphoangiogenesis hyperproliferation resist. to death migration invasion .. ma per molte neoplasie il bersaglio è ben definito estrogen receptor in an infiltrating ductal carcinoma

Alterazioni della funzione di geni che giocano un ruolo importante nell’origine e patogenesi delle neoplasie umane. Tre categorie principali di alterazioni delle funzioni geniche sono alla base della progressione tumorale; queste comprendono geni che codificano per proteine “sopressore” geni che codificano enzimi per il riparo del DNA oncogeni

COSA SI INTENDE PER TARGETED THERAPY Una terapia con un bersaglio molecolare ben definito La “targeted therapy” dovrebbe agire su un processo biologico rilevante (generalmente, anche se non sempre, su una singola molecola) preferibilmente il processo caratteristico della patologia da curare. Il bersaglio dovrebbe poter essere misurabile clinicamente e la misura dell’effetto della terapia sul bersaglio dovrebbe correlare con lo stato di salute del paziente.

TARGETED THERAPY – LE MOLECOLE

Molecole di piccole dimensioni-farmaci più tradizionali Imatinib mesylate (Gleevec, also known as STI–571) Gefitinib (Iressa, also known as ZD1839), targets the epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase Erlotinib (marketed as Tarceva). Erlotinib inhibits epidermal growth factor receptor Bortezomib (Velcade) is an apoptosis-inducing drug that causes cancer cells to undergo cell death by interfering with proteins. Newer BCL-2 antagonists (e.g. Gossypol). The selective estrogen receptor modulator tamoxifen has been described as the foundation of targeted therapy Farmaci biologici – anticorpi monoclonali (chimerici-umanizzati-umani) Rituximab targets CD20 found on B cells. Trastuzumab (Herceptin) targets the Her2/neu (also known as ErbB2) receptor Cetuximab (marketed as Erbitux) targets the epidermal growth factor receptor. Bevacizumab (marketed as Avastin) targets circulating VEGF ligand

Targeted therapy Un trattamento che utilizza farmaci o altre sostanze, quali anticorpi monoclonali, per identificare e agire selettivamente sulla cellula neoplastica …. …..non mirato a colpire tutte le cellule in mitosi (es. la chemioterapia più tradizionale) Targeted therapy deve avere minori effetti collaterali rispetto a trattamenti più tradizionali. Dictionary of Cancer Terms National Cancer Institute USA

PER L’IDENTIFICAZIONE DEL PAZIENTE ALLA TERAPIA MIRATA OCCORRE AFFIANCARE METODI PRECISI: PER L’IDENTIFICAZIONE DEL PAZIENTE PER LA IMMEDIATA VERIFICA DELLA EFFICACIA DEL TRATTAMENTO

FARMACOGENETICA Il prossimo obiettivo per le “targeted therapies” sarà l’identificazione dei pazienti che possono rispondere al meglio alla terapia. La via per l’identificazione di queste-sottopopolazioni sono marcatori e “molecole di misura” surrogati.

Tecnologie per l’analisi dell’immagine applicabili alla verifica degli effetti positivi del trattamento in tempi reali

trattamento di pazienti IL COSTO DEI FARMACI INTELLIGENTI ricerca biologica trattamento di pazienti