LABORATORIO DI ANALISI DEI FARMACI I Docente : Prof. Stefania Villa Istituto di Chimica Farmaceutica e Tossicologica, Via Mangiagalli 25 Tel: 02-50319368; Fax: 02-50319359 Email: stefania.villa@unimi.it http://users.unimi.it/stefaniavilla/ Ricevimento studenti previo appuntamento Crediti: 11 Crediti frontali: 7.5 (60 ore lezione, 30 lezioni) Crediti laboratorio: 3.5 (56 ore, 14 esercitazioni) Propedeuticità frequenza laboratorio: superamento es Chimica Generale Inorganica e frequenza lab. Analisi dei Medicinali Propedeuticità esame: ANALISI DEI MEDICINALI+LABORATORIO DI ANALISI DEI MEDICINALI; chimica analitica

INIZIO LEZIONI 1 OTTOBRE 2008 FACOLTA’ DI FARMACIA Corso di Laurea Specialistica in CTF - 2° anno 1° semestre A.A. 2008-2009 INIZIO LEZIONI 1 OTTOBRE 2008 Studenti linea E-O ORA LUNEDI MARTEDI MERCOLEDI GIOVEDI VENERDI 8.30-9.30 LABORATORIO ANALISI FARMACI I° Prof. Villa 56 ore Via Mangiagalli 25 Inizio 9/10 Inizio 10/10 9,30-10.30 Idem idem 10.30-11.30 60 ore Aula V5 -Via Venezian Aula V8 -Via Venezian 11.30-12.30 12.30-13.30 13.30-14.30 Aula V10 -Via Venezian 14.30-15.30 15.30-16.30 16.30-17.30

Testi consigliati Testi di Chimica analitica: Skoog-West:Chimica Analitica : Edises (seconda edizione) Harris D: Chimica analitica quantitativa, Zanichelli (seconda edizione) Testo di analisi strumentale: COZZI Renato , PROTTI Pierpaolo , RUARO Tarcisio  ANALISI CHIMICA STRUMENTALE Seconda edizione   Testo di analisi farmaceutica: Porretta GC: Analisi di preparazioni farmaceutiche, analisi quantitativa, volume primo, CISU Testo di analisi farmaceutica strumentale: Watson DG: Analisi farmaceutica, ESISES Testo di statistica: J.R. Taylor ; Introduzione all’ analisi degli errori, Zanichelli (seconda edizione)

Programma del Modulo di ANALISI DEI FARMACI I Introduzione ai principi dell’analisi quantitativa chimico-farmaceutica Introduzione alle tecniche analitiche utilizzate per l’analisi quantitativa di sostanze iscritte nella vigente Farmacopea europea Materiali, attrezzatura e tecniche di laboratorio per l’analisi quantitativa chimico-farmaceutica Trattamento e valutazione di dati statistici (trattamento statistico dell’errore casuale, la deviazione std., intervalli di fiducia, t di student, test F, test Q, analisi della varianza, uso di fogli di calcolo nell’analisi chimica) Analisi volumetriche e loro applicazioni all’analisi quantitativa di sostanze iscritte nella vigente Farmacopea europea (titolazioni acido-base, titolazioni con formazione di precipitato, titolazioni redox, titolazioni complessometriche, titolazioni in solventi non acquosi, titolazioni potenziometriche) Polarografia, voltammetria, amperometria Spettroscopia UV-Visibile e sue applicazione all’analisi quantitativa di farmaci secondo Farmacopea europea Introduzione all’analisi cromatografica Gas-cromatografia e sue applicazioni all’analisi quantitativa di farmaci secondo Farmacopea europea Cromatografia liquida ad alte prestazioni e sue applicazioni nell’analisi quantitativa di farmaci secondo Farmacopea europea Analisi di preparazioni specifiche Sviluppo e convalida di un metodo analitico (criteri per la scelta del metodo analitico ottimale, sviluppo e ottimizzazione del metodo strumentale, convalida del metodo analitico) I principi di Buona Pratica di Laboratorio

Programma delle esercitazioni a posto singolo relative al modulo di Laboratorio di Analisi dei Farmaci I 14 esercitazioni di 4 ore Trattamento statistico dei risultati Analisi volumetriche acido-base (determinazione di sodio idrossido, acido acetico, carbonato e bicarbonato sodico) Titolazioni di precipitazione (determinazione del sodio cloruro mediante metodo di Mohr, Fajans, Volhard) Titolazioni complessometriche (determinazione di magnesio cloruro, ferro solfato) Titolazioni redox (determinazione di acido ascorbico e cloramina T) Titolazioni in ambiente non acquoso (determinazione della chinina cloridrato) Determinazione spettrofotometrica dei nitriti e del ferro ferroso (metodo dei minimi quadrati e delle aggiunte std.) Determinazione spettrofotometrica di una miscela di ioni cromo e manganese OBBLIGATORIO CONSEGNA QUADERNO DI LABORATORIO PER SOSTENERE L’ ESAME

Il farmaco e la forma farmaceutica Chiamiamo farmaco (o medicinale) qualsiasi sostanza o composto impiegato nella prevenzione, cura e diagnosi della malattie. Per poter essere somministrato il farmaco deve essere trasformato in forma farmaceutica (formulazione), ovvero la forma con cui lo si trova in farmacia. La Forma Farmaceutica è costituita da uno o più principi attivi e dagli eccipienti. Il principio attivo è la sostanza dotata di attività farmaceutica. All'interno di una forma farmaceutica il principio attivo è contenuto in un dosaggio ben preciso, variabile secondo il tipo di principio, di forma farmaceutica e di finalità terapeutiche. L’eccipiente è invece qualsiasi sostanza diversa dal principio attivo che venga aggiunta intenzionalmente alla forma farmaceutica. Tutti gli eccipienti sono dotati di particolari proprietà, necessarie per ottenere formulazioni con caratteristiche funzionali alla somministrazione. Avremo così: Leganti : danno compattezza alla forma farmaceutica, ne "tengono insieme" i componenti Disaggreganti : controbilanciano l'azione dei leganti e consentono alla forma farmaceutica di disfarsi liberando il principio attivo Glidanti : consentono lo scorrimento dalla miscela principio attivo-eccipienti, facendola defluire in modo uniforme e rapido nello stampo che le darà una forma Lubrificanti : sono impiegati per lo più nella preparazione di compresse, perché facilitano la compressione della miscela principio attivo-eccipienti e l'espulsione delle compresse Coloranti : si utilizzano solo quelli autorizzati ad uso alimentare e servono a rendere più invitante l’aspetto della forma farmaceutica. Aromatizzanti : mascherano gli eventuali sapori sgradevoli.

Le Forme farmaceutiche sono: Aerosol: sono dispersioni di particelle liquide o solide racchiuse in recipienti speciali chiusi ermeticamente (nebulizzatori). Possono essere A USO TOPICO o PER INALAZIONE. Capsule: sono preparazioni costituite da un involucro gelatinoso di consistenza dura (capsule dure) o molle (capsule molli) che contiene una dose di medicamento. Hanno lo scopo di far arrivare il principio attivo opportunamente protetto nella sede in cui questo va rilasciato, per evitare dispersioni di sostanza e/o effetti collaterali. Cerotti Transdermici: sono gli "ultimi arrivati" nei cassetti della farmacia, e assicurano livelli costanti di principio attivo nel sangue e un'azione duratura. Colliri: sono soluzioni o sospensioni sterili, acquose o oleose, destinate ad essere applicate nell'occhio. Vengono preparati con materie prime selezionate e con particolari precauzioni, in modo da assicurare la sterilità, evitando l'introduzione di sostanze contaminanti e lo sviluppo di microorganismi. Compresse: sono preparazioni ottenute comprimendo la miscela principio attivo-eccipienti. Esistono poi le Compresse rivestite: sono compresse che vengono rivestite con uno o più strati di sostanze diverse (resine, gomme, zuccheri, plastificanti, cere..). Una compressa può essere rivestita per diversi motivi: per migliorare l'aspetto estetico, per mascherare odori e sapori sgradevoli, per proteggere il farmaco da luce e umidità, per aumentare la resistenza meccanica, per conferire resistenza al succo acido dello stomaco, o per controllare il tempo di cessione del principio attivo.

Fiale: nelle fiale la sostanza attiva viene preparata in forma liquida Fiale: nelle fiale la sostanza attiva viene preparata in forma liquida. Possono essere somministrate per via intramuscolare, endovenosa o sottocutanea, aerosol. Gocce: sono preparazioni liquide (soluzioni o sospensioni acquose o oleose, emulsioni) destinate alla somministrazione in gocce Orali, Nasali o Auricolari. Pomate: sono preparazioni semisolide da impiegare su pelle o mucose. Si distinguono in: Unguenti - Sono caratterizzati da un eccipiente in fase unica (grassa o acquosa) in cui si disperdono sostanze attive liquide o solide. Creme - Sono emulsioni, formate cioè da due fasi (grassa e acquosa), una prevalente sull'altra. Le più comuni sono particolarmente ricche d'acqua ed evaporano rilasciando la sostanza attiva. Gel - Sono liquidi trasformati in gel con opportuni gelificanti. Paste - Sono preparazioni in cui grandi quantità di polvere sono finemente disperse negli eccipienti (grassi o acquosi). La loro caratteristica è di essere adsorbenti (quindi adatte a imprigionare sostanze chimiche nocive, come l'ammoniaca prodotta per alterazione batterica dell'urina o essudati tipici di alcune malattie della pelle) e opache (quindi adatte a proteggere la pelle dalle radiazioni solari).

Sciroppi: sono preparazioni a base acquosa che contengono principi attivi e sostanze dolcificanti. Consentono la somministrazione di medicamenti poco gradevoli al gusto anche ai pazienti più "difficili", come i bambini. Sospensioni: sono preparazioni in cui la miscela principio attivo-eccipienti viene dispersa, come polvere, in un liquido all'interno del quale non si può sciogliere. Supposte: la sostanza attiva viene miscelata con eccipienti che danno alla preparazione forma e consistenza tali da permetterne l'introduzione nel retto dove il farmaco viene rilasciato e assorbito.

I farmaci possono essere distinti in: Medicinali di origine industriale Specialità Medicinali: preparati e messi in commercio con un nome fantasia (es. aspirina) e in confezioni particolari che non possono essere modificate dal farmacista (le familiari "scatolette" che acquistiamo comunemente) Generici o Galenici Industriali: preparati e messi in commercio con la denominazione comune della sostanza (es. acido acetilsalicilico) o, in sua assenza, con la denominazione scientifica (es. acido o-idrossibenzoico). Il loro confezionamento secondario (confezione più esterna) può essere sconfezionato dal farmacista. Medicinali allestiti in farmacia Galenici Magistrali: medicinali destinati a un determinato paziente e preparati in farmacia su prescrizione medica. Galenici Ospedalieri: medicinali preparati nella farmacia ospedaliera e destinati a essere impiegati all'interno dell'ospedale. Galenici Multipli: medicinali preallestiti, preparati nella farmacia aperta al pubblico o in quella ospedaliera in base alle indicazioni della Farmacopea Ufficiale Italiana e destinati a essere forniti ai clienti della farmacia o all'interno dell'ospedale.

CLASSIFICAZIONE DEI METODI ANALITICI IN BASE AL METODO DI ANALISI I metodi analitici classici permettono di separare i vari analiti presenti in un campione per precipitazione, estrazione e distillazione. Dopo la separazione i componenti vengono fatti reagire al fine di ottenere il loro riconoscimento (analisi qualitativa) mediante reazioni colorimetriche, dalla solubilità nei solventi, dall’attività ottica, dall’odore, in base al punto di ebollizione e di fusione, dall’indice di rifrazione. Le misure quantitative sfruttano invece analisi gravimetriche, determinando la massa dell’analita, o la titolazione, misurando il volume od il peso di un reagente standard richiesto per reagire completamente con l’analita (titolante). I metodi strumentali sfruttano invece segnali analitici di vario tipo, conducibilità, potenziale elettrodico, assorbimento ed emissione di luce, il rapporto massa/carica, la fluorescenza, etc

LE ANALISI QUALITATIVA E QUANTITATIVA Si basano sull’utilizzo di vetreria e reagenti aventi costi contenuti. Il materiale comprato puo’ essere usato per piu’ tipi di analisi Tempi di analisi lunghi Quantità consistenti di campione Distruzione del campione TRADIZIONALI TEST CHIMICI Si basano sull’utilizzo di apparecchiature molto costose che talvolta possono essere usate solo per poche analisi Tempi di analisi brevi Piccole quantità di campione Spesso non sono distruttivi MODERNE TECNICHE STRUMENTALI

METODI DI ANALISI QUANTITATIVA- CLASSICI ANALISI GRAVIMETRICA ANALISI PER TITOLAZIONE

ANALISI QUANTITATIVA CHIMICO-FARMACEUTICA Analisi quantitativa: determinazione della quantità di una o più sostanze note (analiti) di un campione Analita Matrice Metodo analitico Sostanze pure iscritte in Farmacopea europea (EP, V ed.) - Titolazione Spettroscopia UV-VIS Analisi HPLC, GC Principi attivi in forme farmaceutiche Forma farmaceutica Principi attivi e loro metaboliti in matrici biologiche complesse (studi ADME pre-clinici e clinici) Plasma, urine , tessuti Tecniche ifenate (LC-MS; GC-MS)

ANALISI QUANTITATIVA CHIMICO-FARMACEUTICA Analisi quantitativa: determinazione della quantità di una o più sostanze note (analiti) di un campione Analita Matrice Metodo analitico Sostanze pure iscritte in Farmacopea europea (EP, V ed.) - Titolazione Spettroscopia UV-VIS Analisi HPLC, GC Principi attivi in forme farmaceutiche Forma farmaceutica Principi attivi e loro metaboliti in matrici biologiche complesse (studi ADME pre-clinici e clinici) Plasma, urine , tessuti Tecniche ifenate (LC-MS; GC-MS)

Composizione plasma umano L’identificazione di analiti in matrici complesse richiede metodi altamente specifici e sensibili

Sensibilità, specificità e costo!! Titolazione Spettroscopia HPLC-UV-VIS HPLC-MS Sensibilità mg µg ng <pg Costo 0.5-10K € 10-20k € 20-50k € 100-500k € Sensibilità, specificità e costo!!

La Farmacopea Ufficiale della Repubblica Italiana La Farmacopea Ufficiale della Repubblica Italiana risulta costituita dai testi della Farmacopea Italiana XI edizione nonché dai testi della 4° edizione della Farmacopea Europea e successivi supplementi, recepiti direttamente in lingua inglese e francese La XI edizione della FU rimane lo strumento di supporto per il SSN sia in relazione al processo di autorizzazione all’immissione in commercio dei generici che per quanto riguarda l’attività preparatoria delle farmacia ospedaliere e private. L’obiettivo della Farmacopea Europea è la promozione della salute pubblica mediante la messa a punto di norme comuni riconosciute e che devono essere utilizzate dal personale sanitario e da chi coinvolto con la qualità dei medicinali Tali norme o specifiche debbono essere appropriate a costituire la garanzia in materia di sicurezza d’uso dei medicinali per i pazienti e consumatori.

POTASSIUM CHLORIDE 01/2005:0185 corrected 5.2 Kalii chloridum KCl Mr 74.6 DEFINITION Potassium chloride contains not less than 99.0 per cent and not more than the equivalent of 100.5 per cent of KCl, calculated with reference to the dried substance. CHARACTERS A white ►or almost white◄, crystalline powder or colourless crystals, freely soluble in water, practically insoluble in anhydrous ethanol. IDENTIFICATION A. It gives the reactions of chlorides (2.3.1). B. Solution S (see Tests) gives the reactions of potassium (2.3.1). TESTS ….. Loss on drying (2.2.32). Not more than 1.0 per cent, determined on 1.000 g by drying in an oven at 100-105 °C for 3 h. ASSAY Dissolve 1.300 g in water R and dilute to 100.0 ml with the same solvent. To 10.0 ml of the solution add 50 ml of water R, 5 ml of dilute nitric acid R, 25.0 ml of 0.1 M silver nitrate and 2 ml of dibutyl phthalate R. Shake. Titrate with 0.1 M ammonium thiocyanate, using 2 ml of ferric ammonium sulphate solution R2 as indicator and shaking vigorously towards the end-point. 1 ml of 0.1 M silver nitrate is equivalent to 7.46 mg of KCl.

ASCORBIC ACID Acidum ascorbicum C6H8O6 Mr 176.1 DEFINITION Ascorbic acid contains not less than 99.0 per cent and not more than the equivalent of 100.5 per cent of (5R)-5-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxyfuran-2(5H)-one. CHARACTERS A white or almost white, crystalline powder or colourless crystals, becoming discoloured on exposure to air and moisture, freely soluble in water, soluble in ethanol (96 per cent). It melts at about 190 °C, with decomposition. IDENTIFICATION …………. Sulphated ash (2.4.14). Not more than 0.1 per cent, determined on 1.0 g. ASSAY Dissolve 0.150 g in a mixture of 10 ml of dilute sulphuric acid R and 80 ml of carbon dioxide-free water R. Add 1 ml of starch solution R. Titrate with 0.05 M iodine until a persistent violet-blue colour is obtained. 1 ml of 0.05 M iodine is equivalent to 8.81 mg of C6H8O6. STORAGE Store in a non-metallic container, protected from light.

Fluoxetine hydrochlorideFluoxetine hydrochloride Fluoxetini hydrochloridum C17H19CIF3NO Mr 345.8 DEFINITION Fluoxetine hydrochloride contains not less than 98.0 per cent and not more than the equivalent of 102.0 per cent of (3RS)-N-methyl-3-phenyl-3-[4-trifluoromethyl)phenoxy]propan-1-amine hydrochloride, calculated with reference to the anhydrous, acetonitrile-free substance. CHARACTERS A white or almost white, crystalline powder, sparingly soluble in water, freely soluble in methanol, sparingly soluble in methylene chloride. IDENTIFICATION ………………………………………………..

ASSAY Examine by liquid chromatography (2.2.29). Test solution. Dissolve 55.0 mg of the substance to be examined in the mobile phase and dilute to 50.0 ml with the mobile phase. Dilute 10.0 ml of the solution to 100.0 ml with the mobile phase. Reference solution. Dissolve 55.0 mg of fluoxetine hydrochloride CRS in the mobile phase and dilute to 50.0 ml with the mobile phase. Dilute 10.0 ml of the solution to 100.0 ml with the mobile phase. The chromatographic procedure may be carried out using: — a stainless steel column 0.25 m long and 4.6 mm in internal diameter packed with octylsilyl silica gel for chromatography R (5 µm), — as mobile phase at a flow rate at 1 ml/min a mixture of 8 volumes of methanol R, 30 volumes of tetrahydrofuran R and 62 volumes of a solution of triethylamine R prepared as follows: to 10 ml of triethylamine R, add 980 ml of water R, mix and adjust to pH 6.0 with phosphoric acid R (about 4.5 ml) and dilute to 1000 ml with water R, — as detector a spectrophotometer set at 227 nm. When using a recorder, adjust the sensitivity of the system so that the height of the principal peak in the chromatogram obtained with reference solution is at least 50 per cent of the full scale of the recorder. Adjust the volumes of methanol and the solution of triethylamine in the mobile phase so that the retention time of fluoxetine is between 10 min and 18 min. The assay is not valid unless the symmetry factor calculated at 10 per cent of the height of the peak due to fluoxetine is at most 2.0. Inject 10 µl of the test solution and 10 µl of the reference solution. Calculate the content of fluoxetine hydrochloride (C17H19CIF3NO) from the area of the peaks in the chromatograms obtained with the test solution and the reference solution using the stated content of C17H19CIF3NO in fluoxetine hydrochloride CRS and correcting for the content of water and of acetonitrile in the substance to be examined.

IMPURITIES A. R = OH: (1RS)-3-(methylamino)-1-phenylpropan-1-ol, B. R = H: N-methyl-3-phenylpropan-1-amine, C. (3RS)-N-methyl-3-phenyl-3-[3-(trifluoromethyl)phenoxy]propan-1-amine.

Tecniche analitiche utilizzate per l’analisi quantitativa di sostanze iscritte in E.P. (V ed.) e F.U XI ANALISI PONDERALE: insieme di operazioni che debbono essere impiegate per determinare un principio attivo tramite una pesata che rappresenta lo stadio finale della determinazione stessa. Determinazioni ponderali riportate in E.P: carboplatino, balsamo del Perù, alcooli di lanolina, cresolo, magnesio trisilicato, ecc. ANALISI VOLUMETRICA: analisi che è completata misurando un volume di una soluzione a concentrazione nota, necessario per avere una reazione quantitativa con la sostanza che deve essere determinata. Titolazioni acido-base in fase aq. Titolazioni indiretta in fase aq. Titolazioni in solventi non aq. Titolazioni con formazione di precipitato Titolazioni complessometriche e chelometriche Titolazioni redox Titolazioni potenziometriche

ANALISI STRUMENTALE: metodi spettroscopici_ spettroscopia UV-VIS, fluorescenza Metodi cromatografici: HPLC, GC