Lezione del 12/05/2005 e 13/05/05 Anno accademico 2004/05

Farmaci antiinfiammatori non steroidei (COX-inhibitors)

Basi molecolari Acido arachidonico Cicloossigenasi PGH-sintasi Perossidasi PGD-sintasi TX-sintasi

From: Funk CD, Science, 294, 1871, 2001 COX-3 Mucus production, cytoprotection Gastric epithelial cells

Sintesi delle prostaglandine a partire dall’acido arachidonico Tyr 385 Tyr 385 Tyr 385 A. arachidonico entra nel sito catalitico della COX Acido arachidonico Formazione delle prostaglandine

Struttura degli enzimi cicloossigenasici (PGH2 sintetasi o COX) La struttura enzimatica è stata chiarita per cristallografia a raggi X dell’enzima (COX-1: Picot D. et al., Nature 1994;367:243-249; COX-2: Luong C et al., Nat Struct Biol 1996;3:927-933). La struttura riportata nelle seguenti diapositive rappresenta il modello della COX-2 (L.J. Marnett et al., J Biol Chem, 274, 22903-22906, 1999).

Struttura degli enzimi cicloossigenasici (PGH2 sintetasi o COX) L.J. Marnett et al., J Biol Chem, 274, 22903-22906, 1999

Per maggiore chiarezza le frecce aggiunte segnalano i siti descritti nella didascalia. La COX-2 è molto simile come struttura (v. altre diapositive esplicative semplificate)

Struttura degli enzimi cicloossigenasici (PGH2 sintetasi o COX) 4eme 3cat 7Tyr385 5iodo 6 Tyr355, Arg120, Glu524 2MBD 1EGF L.J. Marnett et al., J Biol Chem, 274, 22903-22906, 1999

Struttura degli enzimi cicloossigenasici (PGH2 sintetasi o COX) Fig. 2.   Subunit structure of COX-1. Each COX subunit comprises three domains, an epidermal growth factor domain (yellow 1), a membrane-binding domain (lavender 2), and a catalytic domain (blue cyanite 3). The catalytic domain contains the cyclooxygenase active site and the peroxidase active site separated by the heme prosthetic group (red 4). In the present structure, the cyclooxygenase active site is occupied by a molecule of iodosuprofen (lime 5). Arg-120, Tyr-355, and Glu-524 comprise a H-bonding network that introduces a constriction at the base of the cyclooxygenase active site. They are depicted in gold (6). The volume beneath this constriction is termed the lobby and is bordered on three sides by the membrane-binding domain. The catalytically important Tyr-385 residue is depicted in white (7). The peroxidase active site is at the top of the protein in this drawing and is visible as the wide opening to the heme prosthetic group. L.J. Marnett et al., J Biol Chem, 274, 22903-22906, 1999

Struttura degli enzimi cicloossigenasici (PGH2 sintetasi o COX) H. Feng, Nat Struct Biol 2000;7:448

Struttura degli enzimi cicloossigenasici (PGH2 sintetasi o COX) Gli enzimi (qui visto lateralmente è la PGH2 o COX-2) sono omodimeri ancorati alle membrane degli organuli interni delle cellule (compreso la membrana nucleare); la freccia indica il canale idrofobico attraverso il quale l’ac. arachidonico raggiunge il sito catalitico dell’enzima (eme, Tyr 385)

Alcune caratteristiche COX-1 & COX-2 71 kDa, ~600 a.a. Identificato e clonato intorno al 1991 Substrato: acido arachidonico ed altri acidi grassi COX-1 71 kDa, ~600 a.a. Purificato nel 1976, clonato nel 1988 Substrato: acido arachidonico 63% di omologia, simile affinità per l’acido arachidonico From J. Vane et al., Ann. Rev: Pharmacol Tox., 1998, 38: 97-120

FitzGerald and Loll, JCI, 2001, Volume 107, 1335-1338

Goodman & Gilman’s, 2001 (Per le formule di struttura delle molecole si rimanda al libro di testo)

Basi storiche La storia dei farmaci antinfiammatori comincia 3500 anni fa con l’uso antico di decotti di piante (salice, mirto). 1500 a.C. Gli Egiziani usavano decotti di mirto per i dolori. 400 a.C. Ippocrate usava estratti di corteccia di salice per i dolori del parto. 30 d.C. Celso (De re medica) descrive i 4 sintomi dell’infiammazione: rubor, calor, tumor e dolor ed indica l’estratto di salice per risolverli. 100 d.C. Plinio il giovane, Dioscoride riportano l’uso di derivati del salice e 200 d.C. Galeno descrive la functio lesa

Basi storiche I trial clinico: Il 2 Giugno 1763 il Reverendo Edmund Stone Chipping Norton, Oxfordshire illustra i suoi risultati alla Royal Society: “I have no other motives for publishing this valuable specific, than that it may have a fair and full trial in all its variety of circumstances and situations, and that the world may reap the benefits accurring from it.”

Basi storiche Felix Hoffmann first made acetylsalicylic acid, better known today as aspirin, to ease his father’s arthritis. However, aspirin’s history begins long before Hoffmann’s work with it while he was a chemist at Bayer. Hoffmann rediscovered an old formula from a French chemist, and he spent time on developing and testing aspirin to promote its use. Felix Hoffman

for his work in this respect. Basi storiche In 1971, Dr. John Vane, published in Nature is studies on the action mechanism of Aspirin. 1982 Dr. Vane would win the Nobel Prize in Medicine for his work in this respect. 1927-2004

Inibizione della sintesi delle prostaglandine da parte di farmaci aspirino-simili 0.1 1.0 10 100 1000 20 40 60 80 Indomethacin Aspirin Inhibition (%) Salicyclic acid Log concentration (mg/ml) Vane JR. Nature New Biol. 1971; 231, 232-5

Inibizione delle COX da parte dei FANS Tyr 385 Tyr 385 FANS non selettivi Side pocket Arg 120 Arg 120 Isoleu 523 Acido arachidonico non riesce ad entrare nel sito catalitico delle COX

1a generazione dei FANS Aspirina Dipirone Paracetamolo F. Hoffman C5H6 COOH N CH3 OOCCH3 O N NaSO3CH2N CH3 Aspirina F. Hoffman CH3 Dipirone Knorr, 1883 CH3CONH OH Paracetamolo J.Hopkins University 1877 Von Mehring 1893

Marra D.E & Liao JK- Trends Cardiovasc Med. 2001;11:339-44 Activation of NF-kB. Pro-inflammatory and proliferative stimuli activate NF-kB via activation of IkB kinase (IKK). IKK phosphorylates IkB, leading to its degradation and subsequent translocation of NF-kB into the nucleus.

Il paracetamolo E’ un analgesico, un ottimo antipiretico, ma non è un antiinfiammatorio Sembra inibire l’enzima COX-3, presente soprattutto a livello centrale

Inibitori selettivi COX-3 Chandrasekharan et al., PNAS, 99, 13926-13931,2002

Chandrasekharan NV, …. & Simmons DL Chandrasekharan NV, ….& Simmons DL. - COX-3, a cyclooxygenase-1 variant inhibited by acetaminophen and other analgesic/antipyretic drugs: cloning, structure, and expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 99:13926-31.

IC50, µM IC50, µM Table 1.   IC50 values of selected analgesic/antipyretic drugs and NSAIDs Drug COX-1 COX-2 COX-3 Acetaminophen >1,000 460 Aminopyrine* 688 Antipyrine 863 Aspirin 10 3.1 Diclofenac 0.035 0.041 0.008 Dipyrone 350 52 Ibuprofen 2.4 5.7 0.24 Indomethacin 0.010 0.66 0.016 Phenacetin 102 Caffeine Thalidomide Chandrasekharan et al., PNAS, 99, 13926-13931,2002 All assays were carried out in the presence of 30 µM arachidonic acid. * 4-dimethylaminoantipyrine.

2a generazione dei FANS Acido arilpropionico Ibuprofene 1960-1970 CH3 (CH3)2CHCH2 CHCOOH Acido arilpropionico Ibuprofene Acido arilacetico Diclofenac Acido antranilico Fenamati Derivati indolici Indometacina

3a generazione dei FANS 1980 Piroxicam Lornoxicam Tenoxicam

4a generazione dei FANS Rofecoxib Celecoxib Meloxicam Nimesulide 1995-2000 Rofecoxib Celecoxib 1980-1990 Meloxicam Nimesulide

Struttura della COX-2 Tyr 385 Val 523 Arg 120 Side pocket Arg 120 Hawkey C.J. Lancet 353; 307-314, 1999

Struttura molecolare delle COX Basi molecolari Struttura molecolare delle COX COX-1 COX-2

A view of the "side pocket" found at the side of the COX-2 active site A view of the "side pocket" found at the side of the COX-2 active site. The COX-2–selective inhibitor SC-558 Celecoxib SC-558 Celecoxib FitzGerald and Loll, JCI, 2001, Volume 107, 1335-1338

4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl]benzenesulfonamide, 4-[4-(methylsulfonyl)phenyl]-3-phenylfuran-2(5H)-one

IC50 di FANS per COX-1 e COX-2 COX-1 COX-2 Ratio mM COX2/1 Non selettivi Piroxicam 0.0005 0.3 600 ASA 1.67 278 166 Indometacina 0.028 1.68 60 Diclofenac 1.57 1.1 0.7 Meloxicam 48 0.43 0.09 Selettivi Nimesulide 9.2 0.52 0.06 Celecoxib 15 0.04 0.003 Rofecoxib >1000 0.08 0.0001

La IC50 per la COX-1 è valutata come inibizione della produzione di TXB2 in piastrine isolate dal sangue umano e per la COX-2 come produzione di PGE2 dopo induzione dell’enzima con LPS nelle cellule bianche ottenute dallo stesso campione biologico

Selettività di diversi FANS per la COX-2

Posologia e parametri farmacocinetici di alcuni FANS Dose Assorbimento legame volume % t/2 Elimin (mg/die) p.os % proteine distr. Metabol (h) ASA 2000/4000 90 50 0.15 100 1 rene(80) Indmetacina 50/150 98 90 0.30 85 3 rene(70) Diclofenac 75/150 99 99 0.17 85 2 rene(75) Naproxene 250/750 98 99 0.16 90 10 rene(94) Piroxicam 20 70 99 0.15 90 45 rene(90) Nabumetone 2000/4000 90 99 0.11 100 23 rene(80) Nimesulide 200/400 90 90 0.33 95 4 rene(75) Meloxicam 7.5/15 98 95 -- 99 20 rene(50) Rofecoxib 12.5/25 93 87 -- 99 17 bile(99) Celecoxib 50/400 91 97 -- 99 11 bile(60)

Indicazioni terapeutiche dei FANS Stati infiammatori delle articolazioni, dei tessuti molli, ect. Artriti, osteoartriti, artrosi (trattamento sintomatico) Dolore postoperatorio e terminale in associazione agli oppioidi Mal di testa Dismenorrea Antipiretici negli stati febbrili Chiusura del dotto arterioso di Botallo Attacco gottoso acuto L’ASA è usato come antiaggregante e nella prevenzione primaria e secondaria dell’IMA

Recenti indicazioni terapeutiche dei FANS Poliposi familiare del colon, carcinoma del colon retto, tumori testa-collo in associazione alla radioterapia (Coxib); queste molecole sono anche in studio per altre neoplasie Prevenzione e progressione del morbo di Alzheimer (?)

Effetti collaterali dei FANS Dispepsia, gastrite, ulcere gastriche e sanguinamento gastrointestinale Ritenzione idrosalina, edema e diminuzione della funzionalità renale fino ad insufficienza renale e nefrotossicità Angioedema, orticaria e rinite Asma Epatotossicità (rara)

U.S. Mortality Data for Seven Selected Disorders in 1997. M. M. Wolfe, et al., N.E.J.M., 340, 1888-1899, 1999

Goodman & Gilman’s, 2001

Annualized Incidence of Upper Gastrointestinal Tract Ulcer Complications Alone and With Symptomatic Gastroduodenal Ulcers Numbers above bars indicate events per patient-years of exposure. NSAIDs indicates nonsteroidal anti-inflammatory drugs E. Silverstein, et al., CLASS Celecoxib Long-term Arthritis Safety Study. JAMA 284 (2000), pp. 1247–1255

E. Silverstein, et al., CLASS Celecoxib Long-term Arthritis Safety Study. JAMA 284 (2000), pp. 1247–1255

Cumulative incidence of discontinuation due to gastrointestinal adverse events. Top. The incidence among the overall study sample. Bottom. The incidence among patients who used low-dose aspirin. For both parts, Kaplan-Meier curves display the time course of cumulative incidence of discontinuations due to gastrointestinal adverse events by treatment group. Lisse et al., Ann Intern Med. 139, 539-546, 2003

Editors’ Notes Context Most trials that compare gastrointestinal effects of rofecoxib and nonsteroidal anti-inflammatory drugs examine highly selected patient samples. Contribution This randomized, double-blind, placebo-controlled trial of 5557 patients with osteoarthritis includes patients typical of community practice: older patients with comorbid conditions and patients using aspirin for cardiovascular prophylaxis. Rofecoxib and naproxen therapies were discontinued by 5.9% and 8.1% of patients, respectively, because of gastrointestinal side effects. Among low-dose aspirin users, 5.2% taking rofecoxib and 9.4% taking naproxen discontinued using the drugs. Cautions The trial tested daily doses of medicines for a short period (3 months) rather than long-term, intermittent dosing based on symptoms. –The Editors (Ann Intern Med. 139, Oct. 7, 2003)

Effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs on blood pressure (relative risk and 95% confidence intervals) C J Hawkey and M J S Langman, Gut 52:600-608, 2003

Box 3. Causes of Resistant Hypertension Improper blood pressure measurement, Volume overload and pseudotolerance, Excess sodium intake, Volume retention from kidney disease, Inadequate diuretic therapy Drug-induced or other causes Nonadherence Inadequate doses, Inappropriate combinations Nonsteroidal anti-inflammatory drugs; cyclooxygenase 2 inhibitors Cocaine, amphetamines, other illicit drugs Sympathomimetics (decongestants, anorectics) Oral contraceptives Adrenal steroids Cyclosporine and tacrolimus Erythropoietin Licorice (including some chewing tobacco) Selected over-the-counter dietary supplements and medicines (eg, ephedra, ma haung, bitter orange) Associated conditions Obesity Excess alcohol intake (The JNC 7 Report, JAMA. 2003;289:2560-2571).

Lisse et al., Ann Intern Med. 139, 539-546, 2003

Meccanismi fisiologici regolanti la pressione di filtrazione glomerulare A = condizione fisiologica B = la riduzione della pressione di filtrazione glomerulare determina l’attivazione di meccanismi regolatori C e D = interferenze farmacologiche con il meccanismo regolatorio (riadattata da JC Abuelo, Ann Intern Med, 123: 601-614, 1995)

Swan SK et al., Ann Intern Med 2000;133:1-9

Inflammation L’a.a. è metabolizzato via 5-LOX COX-3 (?)

Cowburn AS et al., - Overexpression of Leukotriene C4 Synthase in Bronchial Biopsies from Patients with Aspirin-intolerant Asthma J. Clin. Invest., 101, 1998, 834-846 AIA = aspirin intolerant ATA = asprin tolerant

Cowburn AS et al., - Overexpression of Leukotriene C4 Synthase in Bronchial Biopsies from Patients with Aspirin-intolerant Asthma J. Clin. Invest., 101, 1998, 834-846 Discussion - That adverse respiratory reactions to aspirin and other COX inhibitors are due to a surge in cys-LT production is evident from the assay of cys-LT metabolites and the clinical efficacy of agents that block biosynthesis or action of the receptor-active cys-LTs. … We have confirmed previous reports that immunostaining for COX-1, COX-2, and 5-LO in bronchial biopsies from AIA and ATA patients is not different, and have extended this finding to FLAP and LTA4 hydrolase and even to a comparison with N subjects. In contrast, there is a profound overrepresentation in AIA bronchial biopsies of cells expressing LTC4 synthase, the integral perinuclear membrane enzyme that forms LTC4…….. This unique difference may provide a basis for the chronic overproduction, and for the aspirin-induced increments in cys-LT production in AIA, and for the lack of adverse responses to NSAIDs in ATA patients and N subjects……

Effetti collaterali di alcuni FANS ASA: sanguinamento, tinnito Indometacina: confusione mentale Paracetamolo: a dosi tossiche o in soggetti alcolisti: danno epatico Coxib: aumento degli eventi cardiovascolari (infarto, ictus, trombosi venosa, embolia polmonare) Salicilati: nel neonato e nella prima infanzia, sindrome epatocerebrale di Reye(-Morgan-Baral) eziologia non chiara, infezione virale + ASA (rara). L’ASA non dovrebbe essere usata nei bambini di età inferiore a 12 anni

Meccanismo di danno del paracetamolo Cells Death

Time to Cardiovascular Adverse Event in the VIGOR Trial Relative risk (95% confidence interval) = 2.38 (1.39-4.00); P<.001..

Incidence of MI, Stroke, and Death in the CLASS Trial, Stratified by Aspirin Use

Mukherjee, D et al., JAMA. 2001;286:954-959

McAdam et al., PNAS, 96:272-277,1999

Table 2.   Urinary PGI-M (pg/mg creatinine) after treatment with placebo, 400 and 800 mg of celecoxib, or 800 mg of ibuprofen Treatment 4-6 h 6-12 h Placebo 117.1  ±  49.4 126.2  ±  63.8  Celecoxib, 400 mg 34.2  ±  7.3** 25.1  ±  5.4** Celecoxib, 800 mg 22.8  ±  8.8** 27.0  ±  11.8** Ibuprofen, 800 mg 51.3  ±  18.8* 39.8  ±  6.3** ** , P < 0.01; *, P < 0.05 for comparisons with placebo. McAdam et al., PNAS, 96:272-277,1999

NO-Aspirin Fiorucci et al.,Gastroenterology. 2003;124:600-7

TRATTAMENTO FARMACOLOGICO DELLA GOTTA E DELLE IPERURICEMIE

Ac. nucleici Purine Ipoxantina Xantina Ac. urico Allopurinolo Xantina ossidasi Allopurinolo

Iperuricemia L'acido urico si forma, per azione dell'enzima xantinossidasi, da xantina ed ipoxantina prodotti dal catabolismo degli acidi nucleici e delle purine derivanti dall'alimentazione (carni) e dalla rigenerazione cellulare. Fisiologicamente, l'acido urico, filtrato dai glomeruli è quasi totalmente riassorbito nel tubulo prossimale, mentre solo una piccola quantità viene simultaneamente secreta nel tubulo. I processi, riassorbimento e secrezione, dipendono da proteine ("carriers") deputate al trasporto di acidi organici. Il risultato netto di questo processo è l’escrezione di circa il 10% dell’urato filtrato e il mantenimento delle normali concentrazioni plasmatiche di urato. In alcune condizioni (gotta, insufficienza renale, radioterapia, chemioterapia antitumorale) l’uricemia è eccessivamente elevata e i cristalli di urato tendono a precipitare nei tessuti (tofi), nelle articolazioni e nei reni, causando artrite gottosa e calcolosi renale.

TRATTAMENTO FARMACOLOGICO DELLA GOTTA E DELLE IPERURICEMIE Farmaci usati nel trattamento dell’attacco acuto: Colchicina (antimitotico, legandosi ai microtubuli di alcune cellule migranti, ne impedisce la chemiotassi e la migrazione) FANS (indometacina, tolmentina) Farmaci usati nella prevenzione dell’attacco acuto: Inibitori dell’uricogenesi (allopurinolo) Enzimi degradanti l’acido urico (rasburicase) Uricosurici (probenecid, sulfinpirazone).

Allopurinolo Riduce la sintesi dell’acido urico attraverso l’inibizione della xantinossidasi. E’ un farmaco di scelta per il trattamento a lungo termine dell’iperuricemia; si somministra per os in unica dose al mattino. E’ complessivamente ben tollerato, ma può causare reazioni allergiche cutanee, che richiedono l’immediata sospensione del farmaco in quanto, anche se raramente, possono essere gravi e potenzialmente fatali (dermatite esfoliativa, necrolisi epidermica tossica). Se utilizzato in pazienti in terapia con mercaptopurina ed azatioprina, bisogna ridurre la dose di allopurinolo (almeno del 25%) perché inibisce il catabolismo di questi farmaci (analoghi delle purine), aumentandone la citotossicità.

Rasburicase E’ la forma ricombinante di un enzima, l’urato ossidasi (assente nell’uomo), che trasforma l’acido urico in allantoina, sostanza idrosolubile rapidamente eliminata con le urine. Questo enzima, inattivo per os, si somministra per via endovenosa, in casi selezionati, che non rispondono all’allopurinalo. Ha un costo molto elevato. Può indurre reazioni allergiche anche gravi.

Uricosurici Trovano utile impiego nel trattamento orale dell’iperuricemia, ma sono controindicati in presenza di tofi, calcolosi renale o insufficienza renale perché favoriscono la precipitazione dei cristalli di urato nel rene. In corso di terapia, occorre prevenire questo fenomeno aumentando l'ingestione di liquidi (almeno 1,5-2 lt/die) ed eventualmente alcalinizzando le urine (ad es. tramite somministrazione orale di citrato sodico e potassico).

Uricosurici Probenecid (solo galenico). E’ l’uricosurico di prima scelta perché è ben tollerato e presenta il minore rischio di cristalluria da urati. Nel tubulo prossimale, il probenecid, oltre a bloccare il riassorbimento dell’acido urico, blocca anche i carriers per la secrezione degli acidi organici (come penicilline, cefalosporine, FANS, sulfoniluree, diuretici tiazidici e dell’ansa, ecc.) inibendone l’eliminazione con l’urina. Per questo effetto è stato utilizzato in passato per aumentare i livelli plasmatici di penicillina G. Sulfinpirazone Ha un’azione uricosurica maggiore rispetto al probenecid, ma è dotato di elevata lesività gastrointestinale. Possiede anche un’azione antiaggregante piastrinica.