1 1 3 2 4 2 3 4 4 4 come separare questi oggetti 6 5 6 5 6 5 5 7 8 9 8 Forma Grandezza Densità 1 3 4 6 7 8 9 10 11 12 2 5 lana pietra cotone lana lana cotone pietra lana pietra cotone pietra cotone 1 2 3 forma 4 grandezza 6 cotone lana pietra 4 8 5 8 4 6 7 8 5 Densità 5 7 9 10 11 12 Differente velocità di rotolamento Diversa grandezza Differente sedimentazione Juang RH (2004) BCbasics

Basic Principles of Protein Purification Cell Organelle Homogenization Macromolecule Small molecule Cell Debris Amino acid, Sugar, Nucleotides, etc Nucleic acid Protein Carbohydrate (Lipid) Ammonium sulfate fractionation Size Charge Polarity Affinity Ion exchange, Chromatofocusing, Disc-PAGE, Isoelectric focusing Reverse phase chromatography, HIC, Salting-out Gel filtration, SDS-PAGE, Ultrafiltration Affinity chromatography, Hydroxyapatite Juang RH (2004) BCbasics

Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico pompa colonna RIVELATORE Soluzione di eluizione Collettore di frazioni

Scambio ionico: separazione in funzione della carica

Importanza del pI -A pH > pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e si lega a una resina a scambio anionico (SCAMBIO ANIONICO). -A pH < pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e si lega a una resina a scambio cationico (SCAMBIO CATIONICO).

Eluizione: -Variazione di pH -Variazione forza ionica -ioni competitivi Scambiatrice di anioni: pH decrescente -forza ionica crescente -anioni competitivi Scambiatrice di cationi: -pH crescente -forza ionica crescente -cationi competitivi

Cromatografia di scambio ionico VANTAGGI Per grandi volumi, Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml), Matrice molto robusta, Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni. SVANTAGGI Proteine allo stesso pH e concentrazioni di sali della colonna. Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.

GEL FILTRAZIONE

Gel filtrazione

Una proteina sconosciuta eluisce a 170 mL: 40,000 Da (40KDa)

Cromatografia di affinità Resina Braccio spaziatore Ligando

Cromatografia di affinità Un ligando ad alta affinità per la proteina è legato alla matrice La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna Le altre proteine vengono “lavate” via. La proteina di interesse viene eluita usando una soluzione di ligando.

Cromatografia di affinità VANTAGGI Alta affinità, costanti di dissociazione nell’ordine del mM, nM o anche pM. Legame tutto o nulla: Possibili molte variazioni (affinity tags) SVANTAGGI L’ingombro sterico spesso abbassa la capacità Il braccio spaziatore può avere influenza sul legame L’eluizione può richiedere un eluente specifico

Affinity tags TAG LIGANDO GST MBP biotina Poli-His Proteina A Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione di proteine ricombinanti. Alla proteina di interesse è legato un tag che presenta affinità con un ligando: TAG GST MBP biotina Poli-His Proteina A LIGANDO Glutatione Maltosio Avidina Nichel, Zinco Anticorpi Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati per cromatografia di affinità con i ligandi legati alla colonna. Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tag attraverso proteolisi specifica.

Cromatografia di affinità con anticorpi

Matrici attivate per immobilizzare uno specifico ligando

Protocollo generale di purificazione proteine

Obiettivi: Cattura Purificazione intermedia Polishing Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio Purificazione intermedia Eliminare la maggior parte dei contaminanti Polishing Ottenere la massima purezza possibile

MEDIANTE ELETTROFORESI CONTROLLO DELLO STATO DI PURIFICAZIONE MEDIANTE ELETTROFORESI

(Cromatografia di ripartizione gas-liquido) Gas cromatografia (Cromatografia di ripartizione gas-liquido)

Schema a blocchi di un gascromatografo

Esempio – separazione gas-cromatografica di urina di paziente con elevata aciduria