Elettroforesi Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine, Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico

Principio: Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico. Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA. Forza elettrica : Fel = q · E Forza frizionale : Ffr = f ·v (f = 6 r ) Quando le forze si bilanciano: q ·E = f ·v q  v = — · E f v q mobilità elettroforetica :  = — = — E f

Applicando un campo elettrico si può avere effetto Joule: V = R I W = R I2 Operare a I costante Dissipare l’eccesso di calore

Acidi nucleici

ELETTROFORESI SU SUPPORTO su carta su gel

Gel di agarosio – Elettroforesi orizzontale

Formazione di un gel di poliacrilammide CH2

Acrilamide, bisacrilamide  monomeri Ione perossodisolfato  iniziatore TEMED  catalizzatore L’ossigeno è un radicale, quindi interferisce con la polimerizzazione

Effetto setaccio del supporto di separazione Grafico di Ferguson: La mobilità elettrofoertica risulta inferiore a quella che ci si aspettera Effetto setaccio del supporto di separazione Grafico di Ferguson: Mobilità elettroforetica in funzione della concentrazione del gel

Effetto “setaccio” in un gel uniforme

MOBILITA’ ELETTROFORETICA ED EFFETTO “SETACCIO MOLECOLARE” Se q  L,  in assenza di gel e’ pressoché indipendente dalle dimensioni molecolari

Migrazione di proteine e DNA in gel di varia porosita’

Visualizzazione del DNA: etidio bromuro luce UV

Poiché il DNA sottoposto ad un campo elettrico migra ad una velocità proporzionale all’inverso del log10 del peso molecolare, facendo migrare il campione in esame insieme ad uno standard di pesi molecolari di dimensione nota è possibile estrapolare il peso molecolare del campione ignoto pozzetti 1 2 3 4 5 6 7 8 -20 -10 -7.0 x distanza in cm dai pozzetti

Utilizzando una serie di frammenti di DNA a peso molecolare noto è possibile costruire una curva di taratura. Ogni banda corrisponde ad un punto le cui coordinate sono costituite, in ascissa, dalla distanza in cm dal pozzetto e, in ordinata, dal Log10 del peso molecolare. Congiungendo tutti i punti, riportati su un grafico semi-logarittimico, si dovrebbe formare una linea approssimativamente retta, da cui, nota la distanza dal pozzetto percorsa da una banda incognita, è possibile estrapolare il peso molecolare approssimativo kb Log kb 0 1 2 3 4 5 6 1.30 1.00 0.80 0.69 0.60 0.47 0.30 0.20 0.00 -0.15 -0.3 X Distanza in cm dal pozzetto X=log10 0,54 100,54= Kb 3,46 20 10 7 5 4 3 2 1,6 1 0.7 0,5

(Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) SDS-PAGE (Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare

SDS-PAGE : elettroforesi discontinua Le tre specie ioniche aggiustano la loro concentrazione in modo che [Cl –] > [proteina-SDS] > [glicinato]. Poiché la quantità di proteina-SDS e’ molto piccola, questa specie si concentra in una banda molto stretta fra la banda del glicinato e quella del Cl –.

Colorazione con Coomassie Colorazione con nitrato di Ag Si possono effettuare valutazioni quantitative delle bande proteiche col densitometro: misurazione della luce trasmessa quando un raggio luminoso è fatto passare attraverso il gel colorato. Si hanno picchi di assorbimento di cui si può calcolare l’area che è proporzionale alla quantità di proteina

Applicazioni della SDS-PAGE Purezza del campione Determinazione del PM Western blot Purificazione della proteina

Applicazioni dell’SDS-PAGE Determinazione del PM

Western blotting

Elettroforesi delle proteine plasmatiche