Citogenetica 2 La citogenetica e` lo studio dei fenomeni genetici attraverso l’analisi citologica dei cromosomi al microscopio. Ferguson-Smith Lezione 2

1) Allestimento della coltura Analisi del cariotipo 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

Allestimento del preparato fitoemoagglutinina (stimola la crescita) colchicina (ultimi 30’) Ipotonica (20’) sangue periferico terreno di coltura 48-96h proliferazione centrifugazione centrifugazione pellet risospeso fissativo fissativo risospensione in poco fissativo allestimento del preparato pellet risospeso centrifugazioni (2-3)

3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine Analisi del cariotipo 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

Metodi colorazione differenziale Colorano una regione specifica di alcuni o di tutti i cromosomi C-bande : tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabili dei cromosomi 1,9,16,Y Creano un’alternanza di bande chiare e scure lungo l’asse del cromosoma specifica per ogni coppia di omologhi.

Cariotipi a confronto 1-3 gruppo A 4-5 gruppo B X-6-12 gruppo C 13-15 gruppo D 16-18 gruppo E 19-20 gruppo F Y-21-22 gruppo G

QM-banding pattern utilizzando la mostarda di quinacrina......

DAPI e QM

C-bande

G-bande

HSA1 HSA14 G QM G QM

R-bande

Analisi del cariotipo 4) Osservazione al microscopio, 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini

Ottima ma….. by GP&NA

Puo’ essere anche cosi’... Cromosomi non ben riconoscibili, difficili anche da contare. Scartare! (potendo) by GP&NA

.. O cosi’ Troppo contratti pero’ si puo’ usare per contarli. Scartare! (potendo) by GP&NA

Selezione delle metafasi Sufficiente Si possono contare Puo’ essere utile per analizzare i cromosomi non sovrapposti by GP&NA

Selezione delle metafasi Discreta Si possono contare, e anche se ci sono alcune sovrapposizioni, si possono analizzare by GP&NA

Selezione delle metafasi Buona Si possono contare, e anche se ci sono alcune sovrapposizioni, la morfologia dei cromosomi e’ buona by GP&NA

Come si fa il cariotipo? 1. SI CONTANO I CROMOSOMI : IMPORTANTE PER SOSPETTARE LA PRESENZA DI ALTERAZIONI NEL NUMERO CROMOSOMICO 2. SI APPAIANO GLI OMOLOGHI PER SIMILARITA’ 3. SI METTONO IN ORDINE SECONDO LA CONVENZIONE by GP&NA

Fare il cariotipo 46 10 9 11 16 by GP&NA

Cariotipo ordinato CARIOTIPO IN QM (indicare il bandeggio) by GP&NA

Diagramma

Terminologia 46,XX - cariotipo normale Femminile 46,XY - cariotipo normale Maschile Questo modo di scrivere ci da’ due informazioni: numero totale dei cromosomi (46) sesso dell’organismo 47,XY,+21 Maschio con 47 cromosomi (invece di 46) ed un cromosoma 21 in piu’ (sindrome di Down) 46,XX,del(14)(q23) del=delezione 46,XY,dup(14)(q22q25) dup= duplicazione 46,XX,r(7)(p22q36) r=ring (cromosoma ad anello)

FISH sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo cromosoma sul vetrino A T C G A T C G denaturazione doppia elica di DNA A T C G ibridazione della sonda sui cromosomi denaturati sul vetrino A T C G osservazione del vetrino A T C G denaturazione A T C G T A G C

Principio della fluorescenza

FISH : microscopio a fluorescenza Osservazione al microscopio fotografia filtro di emissione CCD camera Lampada a vapori di mercurio specchio dicroico filtro di eccitazione Elaborazione al computer obiettivo/ condensatore by GP&NA

FISH: metafase in DAPI Cromosomi 1. denaturati 2. colorati con DAPI by GP&NA

FISH: segnali Sonde puntiformi fluorescenti

FISH: merge Sovrapposizione dell’immagine della sonda sull’immagine del DAPI

SONDE PER FISH

DAPI WCP MERGE SONDA

DAPI PCP MERGE SONDA

SONDE PUNTIFORMI BAC chr1 BAC chrX

COIBRIDAZIONE DI 3 SONDE PUNTIFORMI

COIBRIDAZIONE DI 2 SONDE PUNTIFORMI CON WPC