ITS-HHP PER IL MONITORAGGIO DELLE COMUNITÀ BATTERICHE RUMINALI DI BOVINE ALIMENTATE CON SILOMAIS TRANSGENICO Bt Piano sperimentale Analisi delle comunità microbiche ruminali Cluster Analysis Analisi comparativa degli insilati Riproducibilità del metodo ITS-HHP Silomais controllo Silomais Bt Silomais normale Pre-prova T0 Primo trial T1 Secondo trial T2 Bovina A Bovina B Bovina C Bovina D Borin Sara 1, Cittaro Davide 1, Tamburini Alberto 2, Succi Giuseppe 2, Sorlini Claudia 1 e Daffonchio Daniele 1 Università di Milano, Via Celoria 2, Milano 1 Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e Microbiologiche (DISTAM) 2 Istituto di Zootecnia A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2 A B/C D B* A/B D C Liquido ruminale Nylon bags Bt N N N Il metodo ITS-HHP fingerprinting M M M M M C C+T T T+B T+S B S B+S C+T+B C+T+B+S G+R G R G+C P+T+S C P P+B+S B S M: molecular size marker, C: E. coli, T: B. thuringiensis, S: Serratia marcescens, B: Streptococcus bovis, G: Geodermatophilus obscurus, R: Rhodococcus sp. ITS lungo tRNA 5 ITS3 ITS ITS corto 16S rDNA23S rDNA Molecole omoduplex Molecole eteroduplex Gli spaziatori ribosomali trascritti (Intergenic Transcribed Spacer, ITS) presentano polimorfismi in numero, lunghezza e sequenza. Dopo la loro amplificazione con primer universali che appaiano nella zona terminale del 16S rDNA ed in quella iniziale del 23S rDNA, la loro separazione in gel di poliacrilammide MDE evidenzia bande formate da frammenti omoduplex ed eteroduplex. Lanalisi ITS-HHP, è stato applicato a ceppi appartenenti a specie diverse, singole o co-amplificate, dimostrandone linformatività nel descrivere colture miste. Quando diverse specie sono co-amplificate, si ottengono profili di bande che contengono tutte le bande presenti nei profili dei singoli ceppi. Quando le specie sono affini, come nel caso di B. thuringiensis e S. bovis, si notano bande aggiuntive ( ) costituite da frammenti eteroduplex aventi ciascuna elica proveniente da una specie diversa. Specie ad elevata G+C, come G. obscurus, vengono efficientemente amplificati in coltura mista solo quando sono presenti in quantità preponderante (come nel caso di G+R). LITS-HHP fingerprinting è stato applicato al DNA estratto in due replicati da 2 campioni di liquido ruminale prelevati da ciascuna delle 4 bovine. Il metodo ha dimostrato una buona riproducibilità: tra i campioni è stata calcolata identità di bande pari in media all89%, e valori di similarità tra i profili tra il 98% ed il 69% 4 bovine fistolate sono state alimentate per un periodo pre-prova con silomais commerciale (silomais controllo). Sono stati quindi effettuati 2 trial sperimentali ciascuno di 4 settimane, somministrando insilato preparato con mais transgenico (Novartis Bt evento 176) o con mais isogenico normale, seguendo uno schema a cross over,con inversione della dieta al termine del primo periodo. Nei giorni di prelievo sono stati inseriti nella cavità ruminale per 6 ore dei nylon bags contenenti lo stesso silomais presente nella dieta, con lo scopo di analizzare la microflora che colonizza direttamente il materiale solido introdotto con la dieta. Analisi bromatologiche e di degradabilità ruminale in vivo sono state condotte sui due tipi di insilato, coltivati raccolti ed insilati nelle medesime condizioni, allo scopo di valutare quanto le diete sottoposte alle bovine fossero sostanzialmente diverse. ANALISI LIQUIDO RUMINALE ANALISI CONTENUTO NYLON BAGS (FRAZIONE SOLIDA RUMINALE) Nelle analisi bromatologiche condotte sui 2 silomais non sono state riscontrate differenze statisticamente significative ( <0,05). Alcuni valori sono tuttavia prossimi alla significatività: il silomais Bt contiene più fibra ed acido lattico, in connessione con un minor contenuto in zuccheri solubili, indici che la fermentazione lattica è stata più intensa durante linsilamento. Questi dati sono in accordo con studi precedenti (Masoero et al., 1999, Maydica) Degradabilità % Ore di incubazione nel rumine Silomais Bt Silomais isogenico naturale Silomais controllo Prove di digeribilità in vivo non hanno evidenziato differenze nei 3 silomais in studio MM T0T1T2T0T1T2T0T1T2T0T1T2 Cow A Cow B Cow C Cow D 250 bp T1T2T1T2T1T2T1T2 Cow ACow B Cow CCow D M M 250 bp Liquido ruminale Nylon bags Dai campioni di liquido ruminale e di silomais contenuto dei nylon bags inseriti nel rumine, è stato estratto il DNA totale ed è stato applicato il metodo ITS- HHP fingerprinting. I profili ottenuti, formati rispettivamente da 263 e 219 bande polimorfiche, risultano altamente informativi. È stata costruita una matrice di similarità che riporta per ogni campione la presenza/assenza di ogni banda polimorfica, elaborata successivamente con 2 tipi di analisi statistica: Principal Component Analysis e Cluster Analysis. 3 giorni al termine di ogni periodo Principal Component Analysis I campioni, distribuiti su un grafico bidimensionale sulla base della loro variabilità, sono stati raggruppati in modo da evidenziare differenze correlate ai diversi silomais presenti nella dieta e nei nylon bags, o correlate ai diversi animali studiati. I risultati della PCA indicano che sia i campioni della fase liquida che della fase solida non sono distinti in base alle diverse diete, infatti si trovano su aree sovrapposte. I campioni, di solido o liquido, provenienti dalle 4 bovine si trovano invece su aree più separate. Da questanalisi emerge quindi che la dieta non ha significativamente influenzato la microflora ruminale delle bovine. Popolazioni relativamente distinte, sia nella frazione solida che in quella liquida, sono invece state osservate nei 4 animali. I campioni di liquido o solido della bovina B durante il primo trial sperimentale sono particolarmente diversi dagli altri ( ): questo è probabilmente dovuto al fatto che la bovina B in quel periodo ha subito unoperazione, e pertanto ha riportato variazioni significative nella microflora ruminale. Dim1 15.5% Dim2 5.51% Silomais controllo Silomais Bt Silomais normale Dim1 15.5% Dim2 5.51% A B C D Liquido ruminale Variabilità tra le dieteVariabilità tra le bovine Dim % Dim3 8.84% Silomais Bt Silomais normale Dim % Dim3 8.84% D C B A Nylon bags Variabilità tra le diete Variabilità tra le bovine Lanalisi cluster ha raggruppato i campioni in 2 dendrogrammi di similarità che descrivono significativamente la loro diversità (coefficienti di correlazione 0,87 e 0,93). Anche questanalisi riporta sostanzialmente gli stessi risultati ottenuti con lanalisi PCA: la variabilità esistente tra le comunità batteriche dei diversi animali è superiore alla variabilità creata dai diversi regimi alimentari. Nel liquido ruminale, i campioni della bovina operata (B*) risultano nettamente divergenti dagli altri, sottolineando la variabilità conferita dalloperazione. Analizzando separatamente i campioni da nylon bag di ogni singola bovina, si evidenzia che la microflora di ciascun animale è nettamente differenziata in base al regime alimentare. Questo risultato si presenta solo nei campioni provenienti da nylon bag, e non nel liquido ruminale, che probabilmente risente maggiormente della forte omeostasi ruminale. Bt N N Conclusioni In questo lavoro proponiamo il metodo ITS-HHP, che sfrutta i polimorfismi di lunghezza e sequenza degli ITS tramite la loro separazione in poliacrilammide MDE, per la descrizione di comunità microbiche ambientali. Abbiamo dimostrato che lITS-HHP fornisce fingerprinting altamente informativi, riproducibili e sensibili. Applicato alle comunità eubatteriche ruminali di bovine alimentate con insilato di mais transgenico Bt ed isogenico non transgenico, lITS-HHP ha evidenziato nei singoli animali studiati delle differenze correlate alle diverse diete, in particolare nella microflora associata al silomais direttamente incubato nel rumine. La variabilità riscontrata tra i diversi animali è tuttavia maggiore delle differenze imputabili alle diverse diete che quindi non risultano significative.