Sequenziamento dei genomi Biologia Molecolare Sequenziamento dei genomi
Il pirosequenziamento Il pirosequenziamento può essere automaztizzato grazie all’utilizzo di una tecnologia con micropozzetti. Un pozzetto ha il volume inferiore a 100 pl In un vetrino 6x6 cm possono essere contenuti più di un milione di pozzetti. Il pirosequenziamento può determinare sequenze più corte rispetto al metodo di Sanger ma è possibile parallelizzare il processo perottenere globalmente sequenze molto più lunghe
Il pirosequenziamento Il pirosequenziamento si basa sull apossibilità di rilevare la luminescenza emessa dalla luciferasi che viene attivata (per produzione di ATP) da una reazione accoppiata alla sintesi del DNA. - Il primer si lega allo stampo e viene incubato con: DNA polimerasi, ATP solforilasi, luciferasi e luciferina, apirasi, dNTP, adenosin 5’ fosfosolfato (APS) -nucleotidi trifosfato complementare alla prima base dello stampo viene incorporato dalla polimerasi. Viene rilasciato pirofosfato (PPi) -In presenza di APS, la solforilasi converte stechiometricamente il PPi ad ATP. La luciferasi utilizza l'ATP per produrre (tramite la conversione della luciferina ad ossiluciferina) luce.
Strategie di sequenziamento
Annotazione delle sequenze genomiche Open Reading Frame: Presenza dei codoni di stop Codon usage