Metodi e determinazioni quantitative in farmacologia UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SIENA FACOLTÀ DI FARMACIA DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMEDICHE Metodi e determinazioni quantitative in farmacologia Fusi Fabio

Aspetti generali Farmaco = molecola chimica in grado di produrre effetti attraverso l’interazione con altre molecole. Dai metodi di laboratorio alla sperimentazione clinica. Principi generali del dosaggio biologico e loro applicazione agli studi sull’uomo. Sviluppo di modelli animali  attenuare le differenze tra fisiologia animale e patologie umane. Studi clinici per valutare l’efficacia terapeutica. Principi per la valutazione di rischi e benefici.

Il dosaggio biologico Il dosaggio biologico è la determinazione della concentrazione o della potenza di un farmaco in base all’entità dell’effetto biologico indotto Metodo in grado di valutare gli effetti di un farmaco: Proprietà di sostanze diverse. Proprietà della stessa sostanza in situazioni diverse. Valutazione della risposta biologica Determinazione quantitativa della potenza della sostanza

Il dosaggio biologico Fornire informazioni predittive sugli effetti del farmaco nelle situazioni cliniche. Scelta di modelli in vitro e/o in vivo per valutare gli effetti del farmaco a livello fisiologico Progresso della tecnologia (binding, cellule ingegnerizzate, animali transgenici, ecc.) Comprensione delle basi molecolari delle malattie

Livelli di organizzazione biologica e tipi di misurazioni farmacologiche La parametrazione varia a seconda del livello di organizzazione biologica sulla quale influisce il farmaco. Gli approcci variano da tecniche di biologia molecolare a metodiche chimiche, da studi in vivo e in vitro su animali a studi clinici su volontari sani o pazienti, fino a valutazioni degli effetti a livello socioeconomico.

Utilizzo dei dosaggi biologici Per determinare quantitativamente l’attività farmacologica di sostanze nuove o chimicamente indefinite. Per studiare la funzione di mediatori endogeni. Per determinare la tossicità o gli effetti indesiderati di un farmaco. Essenziale nello sviluppo di nuovi farmaci e nello studio di nuovi sistemi di controllo mediati da ormoni o altre sostanze chimiche Estratti del lobo posteriore della ghiandola pituitaria  aumento della P sanguigna e contrazione dell’utero  vasopressina e ossitocina

Dosaggi biologici su sistemi di valutazione diversi Mediatore ignoto (prostanoidi, NO) Dosaggio parallelo per mezzo della tecnica di superfusione a cascata  identificazione e dosaggio di sostanze ignote presenti nel sangue.

Principi generali del dosaggio biologico Uso degli standard 1950 J.H. Burn: I farmacologi odierni se la prendono con il “braccio del re” ma ingoiano rane, ratti e topi, per non menzionare cavie e piccioni. I dosaggi biologici sono disegnati per misurare la potenza relativa di due preparazioni, di solito una standard di riferimento (sostanza pura) e una ignota

Disegno del dosaggio biologico (1) Un dosaggio biologico deve fornire una stima della dose o della concentrazione della sostanza ignota che determina lo stesso effetto biologico di una dose o concentrazione nota dello standard. Rapporto M di dosi equiattive: non dipende dalla grandezza della risposta selezionata fornisce una stima del rapporto tra la potenza delle due preparazioni Confronto tra l’entità degli effetti prodotti da dosi uguali non fornisce una stima di M Confronto tra la potenza di una sostanza ignota e di una standard per mezzo del dosaggio biologico

Disegno del dosaggio biologico (2) Minimizzare la variabilità biologica Evitare errori sistematici che derivano dalla variabilità Stimare i limiti di errore dei risultati del saggio Analisi delle curve dose-risposta  saggio 2+2: due dosi che giacciono sulla porzione lineare della curva semilogaritmica dose risposta vengono somministrate ripetutamente in modo randomizzato. Curve NON parallele: i due farmaci hanno un diverso meccanismo d’azione  differenze qualitative e quantitative  necessarie determinazioni di ordine di grandezza superiore Curve parallele

La pendenza della curva dipende: Risposte graduali e quantali Risposta misurabile (variazione [glucosio] ematico, contrazione di un organo isolato, ecc.) Risposte discontinue o quantali - tutto o nulla (morte, perdita riflesso di raddrizzamento, ecc.) La pendenza della curva dipende: dal test impiegato dalle variazioni individuali tra animali (variabilità biologica) Analisi statistiche differenti devono essere usate in ciascuno dei due casi.

Dosaggi biologici nell’uomo Farmacologia umana e clinica Studi clinici Volontari sani o pazienti per validare i meccanismi già descritti nell’animale di laboratorio (problemi etici e di sicurezza) (test animale non predittivo) Valutazioni successive su dosi equianalgesiche: effetti collaterali, durata d’azione, sviluppo di tolleranza o dipendenza Misurano l’efficacia terapeutica (molte restrizioni) Valutazione dell’azione analgesica della morfina e della codeina in pazienti affetti da patologie maligne

Modelli animali di malattie (1) Ricoprono un ruolo rilevante nella scoperta di nuovi agenti terapeutici anche se riproducono in modo non perfetto soltanto alcuni aspetti delle malattie umane. Esistono molti modelli sperimentali in grado di predire con una certa accuratezza l’efficacia terapeutica nell’uomo: mal di moto e nausea (furetto in gabbia oscillante) Infiammazione (iniezione di sostanze irritanti nella zampa di ratto) diabete ipertensione ulcera gastrica ecc.

Modelli animali di malattie (2) Il modello animale dovrebbe essere simile alle patologie nell’uomo nei seguenti modi: similarità di fenotipo (malattie psichiatriche) causa comune (spesso complessa o ignota, per es. Alzheimer – necessità di creare modelli “causativi” piuttosto che “sintomatici”) fisiopatologia simile (inapplicabile a depressione e ansia) analoga risposta al trattamento (farmaci che agiscono attraverso meccanismi nuovi o non ancora codificati possono sfuggire)

Approccio genetico alla creazione di modelli animali (1) Attraverso incroci selettivi è possibile ottenere una progenie pura di animali con caratteristiche strettamente simili a certe malattie umane. I modelli genetici sono impiegati in aggiunta a quelli convenzionali di tipo farmacologico e fisiologico. Ratti spontaneamente ipertesi Topi geneticamente obesi Cani portatori di epilessia Ecc.

Approccio genetico alla creazione di modelli animali (2) Animali transgenici con mutazioni ben definite vengono prodotti introducendo delle mutazioni nelle cellule germinali di animali (solitamente topi) che permettono di introdurre nuovi geni (knock-in) o di inattivare geni già esistenti (knock-out) o di mutarli negli animali di una colonia di allevamento. Cambiamenti fenotipici simili a malattie umane per saggiare nuovi farmaci: topi transgenici che sovraesprimono forme mutate della APP o delle preseniline (Alzheimer) topi transgenici che sovraesprimono la sinucleina (Parkinson) topi transgenici con sottotipi recettoriali inattivati

Mutagenesi condizionata Approccio genetico alla creazione di modelli animali (3) Limitazioni morte dell’animale durante la gestazione o subito dopo la nascita instaurarsi di cambiamenti adattativi alterazione del controllo o delle funzioni di altri geni a causa dell’incorporazione di nuovo materiale genetico Mutagenesi condizionata i geni introdotti vengono espressi soltanto in alcune cellule (per es. neuroni) i geni introdotti possono essere attivati o spenti da un segnale esterno (interferone)

Studi clinici (1) Una prova clinica è un tipo particolare di dosaggio biologico impiegato per paragonare obiettivamente i risultati di due o più procedure terapeutiche. Per farmaci nuovi  fase II e III del protocollo sperimentale clinico. NB: molti farmaci di indubbia efficacia rimangono in uso senza mai essere stati sottoposti a studi clinici controllati.

Studi clinici (2) Scopo: confrontare direttamente un farmaco da saggiare (A) con uno standard (B) a un singolo livello di dosaggio A può anche essere: combinazione nuova di farmaci noti intervento chirurgico dieta trattamento fisioterapico ecc. NB: In anticipo deve essere decisa la dose e la frequenza delle somministrazioni.

Studi clinici (3) L’uso dei controlli è cruciale nelle prove cliniche. Gruppo di pazienti differenti (randomizzazione  problemi etici) Stesso gruppo di pazienti (sperimentazione cross-over)

Studi clinici (4) Risultato: B meglio di A B peggio di A nessuna differenza significativa NB: diversamente dai saggi biologici viene paragonata l’efficacia non la potenza Sono importanti anche: prevalenza e gravità di eventuali effetti collaterali risposta peggiore o migliore in particolari categorie di pazienti Studi più complessi con elevato numero di pazienti

Studi clinici (5) Anche se la domanda di base è meno sofisticata di quella posta da un convenzionale saggio biologico, l’organizzazione è notevolmente più complessa, lunga e costosa soprattutto in considerazione dell’assoluta necessità di evitare influenze soggettive legate alle aspettative da parte del soggetto e dell’osservatore (BIAS): randomizzazione (assegnazione casuale dei soggetti ad A e B tenendo conto di età, sesso, gravità della patologia = randomizzazione stratificata) disegno sperimentale in doppio cieco (né il soggetto né il ricercatore sanno se viene usato A o B per evitare influenze sullo studio) prova clinica controllata (prevede un confronto tra A e B, e non uno studio di A)

Studi clinici (6) Considerazioni etiche e di ordine economico impongono il coinvolgimento del minor numero di soggetti possibile. La statistica ci dice in anticipo il numero necessario per poter ottenere un risultato attendibile anche se non assolutamente conclusivo. Se il campione non è rappresentativo dell’intera popolazione si possono compiere errori di: tipo I (falso positivo) tipo II (falso negativo) Potenza di uno studio clinico: probabilità di evitare errori di Tipo II

Studi clinici (6) Studi sequenziali (Armitage, 1975): riduzione al minimo del numero di soggetti utilizzati attraverso la valutazione progressiva e continua dei risultati con il procedere dello studio per sospenderlo al raggiungimento del risultato (a un livello predeterminato di significatività e di potenza). Valutazione del risultato clinico Efficacia clinica oggettiva: misurazioni fisiologiche (P, funzionalità epatica), risultato a lungo termine (sopravvivenza), valutazioni soggettive (attenuazione del dolore) Miglioramento della qualità della vita Miglioramenti sociali ed economici Anni di vita di qualità migliore (Quality-Adjusted Life-Years, QALY) = misura generale dell’efficacia terapeutica che correla il tempo di sopravvivenza all’attenuazione della sofferenza.

Definizione della Quality-Adjusted LifeYears associata ad un trattamento.

Placebo Finta medicina, procedura chirurgica o dieta Risposta al placebo: potente effetto terapeutico in grado di apportare un beneficio significativo a circa un terzo dei pazienti. Pochi studi paragonano il placebo con il gruppo di controllo non trattato: molti sintomi migliorano spontaneamente il paziente è incline a riportare cose che facciano piacere al medico curante Rischi: minare la fiducia dei pazienti nell’integrità professionale dei medici dipendenza dalla terapia (non si capisce se il paziente ha ancora bisogno del placebo)

Meta-analisi È una tecnica statistica utilizzata per valutare complessivamente e riunire I dati originati da parecchi studi indipendenti  livelli più elevati di potenza e significatività. Vantaggi: Dati contraddittori Svantaggi: Mancata pubblicazione di dati negativi Doppia conta degli stessi dati

Determinazione dei rischi e dei benefici (1) Ehrlich: un farmaco non deve essere giudicato solamente dalle sue proprietà utili, ma anche dai suoi effetti tossici DL50 Indice terapeutico = ------ DE50 Fornisce un’idea del margine di sicurezza di un farmaco. Limitazioni: DL50 non è un buon indice di tossicità Reazioni indesiderate sono mascherate nel test di DL50 (reazioni idiosincrasiche, stato clinico del paziente) DE50 dipende dal parametro considerato (aspirina)

Determinazione dei rischi e dei benefici (2) L’indice terapeutico: ha scarso valore come parametro di utilità clinica di un farmaco è una misura molto grossolana della sicurezza (talidomide) è basato su dati di tossicità animale che possono non riflettere forme di tossicità clinicamente importanti può essere inteso come misura del margine di errore ammissibile nel somministrare un dato farmaco in dosi superiori a quelle terapeutiche (benzodiazepine hanno soppiantato i barbiturici)

Altri metodi per determinare rischi e benefici (1) Number needed to treat (NNT): il numero di pazienti che deve essere trattato per poter mostrare un dato effetto, sia benefico sia indesiderato. Efficacia antidolorifica di farmaci antidepressivi: Beneficio NNT = 3 Effetti indesiderati minori NNT = 3 Effetti collaterali importanti NNT = 20 Su 100 pazienti: 33 avevano tratto beneficio 33 avevano mostrato effetti collaterali minori 5 avevano mostrato effeti indesiderati più gravi

Altri metodi per determinare rischi e benefici (2) NNT è utile per guidare le scelte terapeutiche. Può tener conto della malattia trattata nel quantificare il beneficio. Se il farmaco A riduce del 50% la mortalità di una malattia spesso fatale (riducendola dal 50% al 25%) = NNT per salvare una vita è 4. Se il farmaco B riduce del 50% la mortalità di una malattia raramente fatale (riducendola dal 5% al 2.5%) = NNT per salvare una vita è 40. A è di maggior valore rispetto a B sebbene entrambi riducano la mortalità del 50%. Inoltre per salvare una vita devono essere esposti al rischio di un effetto collaterale 40 pazienti col farmaco B ma solo 4 col farmaco A.