PCR Prof. Vincenzo Nigro Dipartimento di Patologia Generale, Seconda Università degli Studi di Napoli Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM)

1978 Prima diagnosi molecolare sul DNA *Primo ormone umano ricombinante (insulina) *Premio Nobel agli scopritori degli enzimi di restrizione *Identificato l’AIDS *Prodotto il depakene (epilessia) *Prima bambina in provetta (Luise) *Appare sul mercato l’Apple Computer ed i floppy disk

Com’era l’analisi genetica prima della PCR? Il Southern blotting (1975) permetteva un’analisi approssimativa dei geni (RFLPs, inserzioni & delezioni) Il sequenziamento del DNA (1978) richiedeva che I geni venissero prima clonati in appositi vettori (plasmidi o fago l) La costruzione di genoteche e lo screening potevano richiedere molti mesi e le genoteche dovevano essere preparate per ciascun individuo analizzato

Restriction Enzymes cut in different ways:

L’invenzione della PCR Ideata da Kary Mullis nel 1983 La prima pubblicazione è apparsa nel 1985 Premio Nobel per la chimica nel 1995

1985 Descritta la reazione di PCR Parte il progetto genoma umano Costo giornale £ 650 Tazzina Caffè £.400

Polymerase Chain Reaction - PCR La PCR rappresenta la seconda rivoluzione nelle tecniche di manipolazione del DNA E’ essenzialmente una tecnica di amplificazione del DNA Molte molecole DNA (singola molecola) PCR amplificazione

Polymerase Chain Reaction Metodo per l’amplificazione esponenziale di sequenze di DNA Ingredienti di base Stampo di DNA o RNA 2 primers complementari a differenti regioni dello stampo DNA polimerasi termostabile 4 nucleotidi il buffer appropriato

DNA Schema della PCR DNA RNA Rivelazione Reverse transcription Estrazione del DNA o RNA dal campione DNA Reverse transcription RNA Amplificazione DNA Rivelazione

TIPICA MISCELA DI REAZIONE 25 o 50l in una provetta micro Eppendorf (0.2 o 0.5 ml) COMPONENTE VOLUME Concentrazione finale 10 X PCR Buffer 5l 1X 10 X dNTPs (2mM) 200M Forward primer (5 pmols/l) 0.5M Reverse primer (5 pmols/l) 0.5M (25pmols/50l) DNA genomico stampo 2l 1g polimerasi termostabile (5U/l) 0.2l 1 unità H2O (a 50l di volume finale) 27.8l  

I cicli della PCR 30–35 cicli ciascuno comprendente: denaturazione (95°C), 10-40 sec annealing (50–65°C), 30-120 sec polimerizzazione (68-72°C), il tempo dipende dalla lunghezza del frammento

Thermal cycler, AppliedBiosystems

Thermal Cyclers, MJ Research

Thermal Cyclers, MJ Research

“Tutti I blocchi sono uguali ma alcuni sono più uguali di altri!” Taken from -http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/PCR.html

Synthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C * * A C G -T 5’ 3’ T A C G T A Uno specifico DNA a singola elica (primer o innesco) ibrida con l’elica che deve essere copiata

Come funziona la PCR Come fa la polimerasi a sapere quando fermarsi una volta che ha raggiunto l’altro primer? PCR animation alla “Dolan DNA Learning Center, CSHL, Cold Spring Harbor”

Quanto è potente la PCR? La PCR può amplificare fino ad ottenere una quantità utilizzabile di DNA (visibile su gel) in meno di 2 ore Lo stampo di DNA non necessita di particolari purificazione se il frammento da amplificare è di dimensioni ridotte (fino a 1000bp) Il prodotto della PCR può essere digerito con enzimi di restrizione, sequenziato o clonato La PCR può amplificare una singola molecola di DNA (es. uno spermatozoo)

Elettroforesi su gel : Separa le molecule per dimensione separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA separation verticale --> Acrilamide = DNA, proteine ed RNA le molecole più piccole migrano nel gel più velocemente

Elettroforesi su gel: visualizzazione diretta delle molecole separazione orizzontale --> Agarosio = DNA ed RNA

Il DNA colorato con bromuro di etidio emette una fluorescenza di colore rosso-arancio se sottoposto a luce UV

Download Sequence Data THE GENOMIC SEQUENCE                       Fifty years after the double helix, the reference DNA sequence of Homo sapiens is now available for downloading. Annotation of genes and other features is in progress.      Download Sequence Data

UCSC Genome Browser on Human July 2003 Freeze Screenshot from University of California at Santa Cruz http://genome.ucsc.edu PTEN gene

Mutation screening from genomic DNA

Mutation screening from RNA by RT-PCR

Quante copie? Nessun prodotto fino al 3° ciclo L’accumulazione non è un raddoppiamento completo dopo ciascun ciclo Dopo 32 cicli ci dovrebbero essere max 1,073,741,764 copie di lunghezza definita (~1109)

How Big A Target? Amplification products are typically in the size range 100-1500 bp. Longer targets are amplifiable — >25 kb. Requires modified reaction buffer, cocktails of polymerases, and longer extension times. Limited by the integrity of the starting target DNA — > 50 kb.

Designing PCR Primers Primers should be ~20 bases long. The G/C content should be 45–55%. The annealing temperatures should be within 1°C of one another. The 3´-most base should be a G or C. The primers must not base pair with each other or with themselves or form hairpins. Primers must avoid repetitive DNA regions.

Primers That Form Dimers A primer may form a dimer with itself or with the other primer. 5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´ |||||||||| 3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´ Primer dimers can be an excellent, but unwanted, substrate for the Taq polymerase.

Primers That Form Hairpins A primer may be self-complementary and be able to fold into a hairpin: 5´-GTTGACTTGATA ||||| T 3´-GAACTCT The 3´ end of the primer is base-paired, preventing it annealing to the target DNA.

Optimising the PCR Reaction Annealing temperature of the primers. The concentration of Mg2+ in the reaction. The extension time. (The denaturing and annealing times.) (The extension temperature.) (The amount of template and polymerase — “more is less”.)

Optimising the Annealing Temperature Primers have a calculated annealing temperature (e.g. 54°C). Temperature must be confirmed practically. Temperature steps of 2°C above and below. Use gradient cycler.

Optimising the Mg2+ Concentration The fidelity of the PCR depends on [Mg2+]. Vary [Mg2+] in steps of 0.5 mM. Sometimes a compromise between yield and specificity.

ADDITIVi? DMSO Formamide Glicerolo QIAGEN – Q Stratagene - Perfect Match

Nested PCR

False positive PCR Contamination at the time of specimen collection during transport in the laboratory from other patient samples or positive control material negative controls used to detect contamination Primers are not specific enough do additional confirmatory tests PCR for other targets, additional tests to confirm the identity of the product

General applications of PCR (1)

General applications of PCR (2)

Restriction site polymorphism analysis by PCR

Genotyping

Allele-specific PCR

Fidelity of the Reaction Taq DNA polymerase lacks the 3´5´ proof-reading activity commonly present in other polymerases. Taq mis-incorporates 1 base in 104. A 400 bp target will contain an error in 33% of molecules after 20 cycles. Error distribution will be random.

Do Errors Matter? Yes, if you want to clone the amplified DNA — an individual molecule may harbour several mutations. No, if you want to sequence the amplified DNA or cut it with restriction enzymes. Use a proof-reading thermo-stable enzyme rather than Taq.

Cloning PCR Products Products should be ligatable into blunt-ended restriction enzyme site. Lower than expected efficiency. Products are not truly blunt-ended. Taq polymerase adds a single non-templated base (usually A) to the 3´ end: NNNNNNN…NNNNNNNA ANNNNNNN…NNNNNNN

Cloning of PCR products

Can I PCR Amplify RNA? Not directly — the DNA polymerase requires a DNA template and will not copy RNA. mRNA can first be copied into cDNA using reverse transcriptase. cDNA is a template for PCR — it need not be double-stranded.

Multiplex PCR PCR reactions can be devised in which several targets are amplified simultaneously — often used in diagnostic applications.

Sequencing PCR products

Automated DNA sequencing