Presentazione Progetto Inceneritori Bologna 13 aprile 2007 Linea 5 Valutazione degli effetti tossicologici dell’aria prelevata in prossimità degli impianti di incenerimento Presentazione Progetto Inceneritori Bologna 13 aprile 2007

Individuare i meccanismi d’azione Obiettivi intermedi Analizzare il profilo tossicologico di campioni d’aria prelevati in aree circostanti l’inceneritore a confronto con campioni d’aria non interessati dall’impianto Individuare i meccanismi d’azione Identificare marcatori specifici dell’esposizione Bologna 13 aprile 2007

Obiettivo finale Predizione del rischio da esposizione a impianti attualmente in funzione Bologna 13 aprile 2007

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CANCRO Esposizione Attivazione AM Accumulo Particelle Infiammazione Acuta Infiammazione Cronica Fibrosi Meccanismi Genetici Meccanismi Epigenetici CANCRO Proliferazione Cellule Epiteliali Metaplasia Bologna 13 aprile 2007

Risom et al. Mutat. Res. 592: 119, 2005 Bologna 13 aprile 2007

Le azioni: 1 Bologna 13 aprile 2007

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Il test di Ames Bologna 13 aprile 2007

Test di genotossicità COMET Micronucleo Diventato popolare negli anni ’90 Probabilmente uno dei test più usati per valutare la genotossicità 3117 lavori recensiti in PubMed Micronucleo Considerato uno dei test più affidabili per valutare la genotossicità Rete internazionale di convalidazione per esposizioni ambientali e occupazionali Bologna 13 aprile 2007

Le azioni: 3 Bologna 13 aprile 2007

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Il modello BALB/c 3T3 Uno modello in grado di verificare le capacità trasformanti di composti singoli e miscele complesse e di predire la potenza cancerogena Comprende differenti test che consentono di descrivere il ruolo e il peso della miscela in esame nel processo di cancerogenesi Test di citotossicità Test di trasformazione in cellule BALB/c 3T3 Test di trasformazione in 2 fasi: iniziazione/promozione Test delle comunicazioni intercellulari GJIC Valutazione dell’impatto di promoventi sulla interazione cellula-cellula Test di chemiotassi/chemioinvasione Valutazione delle tappe tardive della cancerogenesi multifasica Test di apoptosi toxicity assessment Bologna 13 aprile 2007

Il modello BALB/c 3T3 Il modello: Descrive la tossicità della miscela Analizza la potenzialità cancerogena Individua relazioni dose-risposta Adatto allo studio di miscele complesse ambientali toxicity assessment Bologna 13 aprile 2007

Il modello BALB/c 3T3 Il test di trasformazione cellulare misura un endpoint facilmente individuabile rappresentato dal focus trasformato Il numero dei foci maligni è direttamente correlato con la dose toxicity assessment Bologna 13 aprile 2007

FREQUENZA DI TRASFORMAZIONE (TF) numero foci/ efficienza clonale ARPA – Eccellenza Cancerogenesi Ambientale formazione di foci ENDPOINT FINALE FREQUENZA DI TRASFORMAZIONE (TF) numero foci/ efficienza clonale Bologna 13 aprile 2007

Disegno sperimentale in vitro: modello 3T3 Il test di trasformazione BALB/c 3T3 Ripercorre le tappe del processo multifasico tumorale E’ utilizzato da molti anni come test di screening per agenti cancerogeni E’ ritenuto un ottimo test per discriminare tra agenti genotossici e non genotossici Ha buone capacità predittive, alta sensibilità e specificità per la valutazione di composti citotossici e non citotossici Bologna 13 aprile 2007

Effetti cronici miscela TEST CITOTOSSICITA’ Effetti acuti miscela TEST TRASFORMAZIONE PM10 - PM2.5 ultrafini Effetti cronici miscela Profilo Tossicologico della miscela complessa Relazioni dose-risposta 1 sola dose 3 dosi Predizione del rischio cancerogeno Bologna 13 aprile 2007

Le azioni: 4 Bologna 13 aprile 2007

Genomica funzionale La tecnologia microarray si basa sull’abilità di ogni acido nucleico a singolo filamento di accoppiarsi alla sequenza complementare Bologna 13 aprile 2007

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controllo esposto ibridazione lavaggi scanner m-RNA m-RNA ibridazione lavaggi scanner Bologna 13 aprile 2007

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Bioinformatica e Data Mining Feature Extractor Primo screening dei dati provenienti dallo scanner. Il software ha il compito di segnalare quegli spot troppo intensi, non uniformi Normalizzazione Rende confrontabili i campioni etichettati con Cy3 e Cy5 ed ibridati congiuntamente su un singolo microarray. Elimina errori sistematici dovuti a: diversa quantità di mRNA associata ad ogni marcatore diversa efficienza di incorporazione dei due marcatori diversa intensità di radiazione emessa dai due marcatori differentemente misurata dal tubo fotomoltiplicatore differenti intensità misurate in diverse parti del microarray a causa del posizionamento non perfettamente orizzontale del microarray rispetto al laser dello scanner differenze tra gruppi di spot creati da differenti penne Controllo qualità della slide Analisi statistica dei dati Maanova di R LIMMA Interpretazione biologica: GoMINER High-Throughput Integra i risultati di molteplici microarray in una singola analisi Organizza la lista di geni modulati nel contesto di Gene Ontology un database che contiene una classificazione dei geni in categorie gerarchiche basate su processo biologico, funzione molecolare e compartimento cellulare Bologna 13 aprile 2007

Tossicogenomica: la validità dell’approccio L’espressione genica è influenzata direttamente o indirettamente dall’esposizione ambientale L’espressione di alcuni geni è essenziale per l’insorgenza della malattia e della sua progressione Le variazioni nella espressione dei geni mostrano una migliore sensibilità e specificità I profili genici relativi a una specifica esposizione) possono essere usati per: Biomarcatori di esposizione Biomarcatori di rischio Biomarcatori di stadio preclinico VARIAZIONE GENE FINGERPRINT PREDIZIONE DEL RISCHIO Bologna 13 aprile 2007

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Cancer potency-slope estimates Risk assessment Procedura per stimare la probabilità che una esposizione possa costituire un pericolo per la salute Slope factor Incremento del rischio di tumore misurato sull’aspettativa di vita in risposta a una esposizione Quale risposta? Bologna 13 aprile 2007

Quali modelli? In contrast to the 1986 guidelines there is no a priori focus on animal cancer bioassay EPA’s revised cancer risk guidelines, 1998 Analisi integrata di tutta l’evidenza scientifica Proprietà fisico-chimiche dei composti Correlazioni struttura-attività Informazioni farmacocinetiche Studi meccanicistici Bologna 13 aprile 2007

Focus sui modelli in vitro Limiti degli studi a lungo termine nell’animale Costi elevati Specificità di specie e di ceppo Peculiarità nelle vie di somministrazione Difficoltà nell’estrapolazione all’uomo Pochissimi dati su miscele complesse Interesse internazionale a trovare test alternativi REACH Bologna 13 aprile 2007

Dati di letteratura Bologna 13 aprile 2007

Dati di letteratura Bologna 13 aprile 2007

Dati di letteratura Bologna 13 aprile 2007

La nostra esperienza Bologna 13 aprile 2007

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D A C E B Bologna 13 aprile 2007

Campagna Estiva A 23 <4 B 16 C 17 D 12 5 E 21 7 Postazione NO2 µg/m3 HCl A 23 <4 B 16 C 17 D 12 5 E 21 7 Bologna 13 aprile 2007

Campagna Autunnale A 23 <4 B 51 C 24 D 22 E 26 Postazione NO2 µg/m3 HCl A 23 <4 B 51 C 24 D 22 E 26 Bologna 13 aprile 2007

Campagna Invernale Bologna 13 aprile 2007

Frequenza di trasformazione nei diversi siti Bologna 13 aprile 2007