Cellule staminali da Epidermide, Pancreas, Fegato

PELLE organo più esteso del corpo, promettente riserva locale di diverse popolazioni di cellule staminali adulte, incluse cellule staminali “committed” e popolazioni staminali pluripotenti.

EPIDERMIDE: funzione di protezione È un epitelio pluristratificato ad elementi labili. È formata da 5 strati di cheratinociti, nel cui contesto si trovano altre cellule. L'epidermide si accresce dalle cellule basali verso lo strato corneo, con un processo di cheratinizzazione che ha una durata di 3-4 settimane e che si conclude con la formazione di cheratina (ammassi cornei) a diretto contatto con l'esterno.

Lo strato basale contiene due tipi di cheratinociti : Stem cells: indifferenziate, slowly-cycling, ampia capacità di proliferazione. Transit amplifying cell (TA): replicazione rapida, limitato potenziale proliferativo.

Localizzazione delle stem cells nella pelle Epidermide: strato basale (organizzazione in clusters) strato spinoso e granulare follicoli piliferi (porzione esterna) Derma: follicoli piliferi cellule non follicolari Le stem cells del derma possono dare origine: -cellule neuronali (neuroni e glia) -derivati del mesoderma (osteociti, condrociti, cellule muscolari e adipociti) -cellule ematopoietiche

Vantaggi per l’utilizzo di cellule staminali epidermiche Le cellule sono facilmente accessibili ed isolabili (biopsia cutanea) Le cellule presentano alcuni privilegi immunitari (basso numero di cellule immunitarie) : potenziale uso per trapianti allogenici Utilizzo come bersaglio in terapia genica e in ingegneria tissutale

Organizzazione dei cheratinociti nell’epidermide umana

Integrine espresse nei cheratinociti a2b1 (collagen receptor) a3b1 (laminin receptor) a5b1 (fibronectin receptor) a6b4 (laminin receptor) avb5 (vitronectin receptor) Le stem cells esprimono alti livelli delle b1 integrine rispetto alle TA: questo consente di isolare ciascuna subpopolazione di cheratinociti e di determinarne la sua localizzazione a livello dell’epidermide

L’espressione costitutiva di c-Myc promuove il differenziamento terminale regolando la transizione dal compartimento staminale al transit amplifying

Caderine espresse nei cheratinociti E -P- caderine: molecole di adesione che mediano le adesioni intercellulari calcio-dipendente L’alterazione dell’espressione di tali molecole comporta una diminuzione della proliferazione dei cheratinociti ed un incremento del differenziamento terminale Le molecole di adesione rappresentano una importante componente della nicchia della cellula staminale

Prelievo di cute per la coltivazione dei cheratinociti E’ praticamente simile ad una biopsia cutanea. E’ necessario inviare al laboratorio un piccolo frammento di cute a tutto spessore del paziente (2 cm x 1 cm) prelevato da un’area sana, possibilmente nascosta (regione retroauricolare, regione inguinale) I cheratinociti coltivati saranno pronti dopo un tempo medio di circa tre settimane.

Tecnica di coltivazione dei cheratinociti su fibrina La fibrina non induce variazione clonale e perdita di cellule staminali epidermiche La velocità di crescita ed il potenziale di proliferazione non sono alterati dal nuovo sistema culturale L’attecchimento dei cheratinociti nei siti di innesto è alta, riproducibile e permanente La fibrina riduce significativamente i costi delle colture autogene ed elimina i problemi relativi al maneggiamento e trasporto

I cheratinociti coltivati in vitro generano foglietti coesivi di epitelio stratificato che mantiene le caratteristiche dell’epidermide Colture di cheratinociti autologhi sono ampiamente utilizzate per il trattamento di estese aree ustionate e per la rigenerazione epidermica LIMITI: infezioni, preparazione del sito di innesto (dermoabrasione, escarectomia o necrectomia, escarotomia)

- fibrina + fibrina

Trattamento di pazienti con estese ustioni Ustioni sul 45-50% della superfice corporea Escarectomia mediante escissione tangenziale del tessuto Preparazione del sito di innesto Rigenerazione epidermica completa e stabile Transplantation, 1999, 68(6):868-879

Pancreas

Stem cells pancreatiche -I progenitori pancreatici svolgono un ruolo maggiore durante lo sviluppo embrionale -Non ci sono evidenze che dimostrano in maniera definitiva la presenza di progenitori pancreatici o di stem cells nell’organismo adulto: sembra che il meccanismo di regolazione delle cellule beta sia dovuto ad un self-duplication piuttosto che ad un differenziamento delle stem cells -Sembra plausibile che i progenitori intervengano in determinati momenti di stress contribuendo al mantenimento dell’equilibrio tissutale: “facultative progenitors”

Stem cells pancreatiche -Localizzazione: dotto pancreatico -La replicazione delle cellule ( incorporazione BrdU) del dotto incrementa in seguito a diversi insulti che provocano un danno tissutale -Il destino di queste cellule ed il loro contributo al pancreas esocrino ed endocrino resta ancora da dimostrare

Stem cells pancreatiche -Osservazione: cellule Beta isolate nel tessuto esocrino -Ipotesi: cellule presenti negli acini possono transdifferenziare in cellule endocrine -Il destino di queste cellule resta ancora da dimostrare

Stem cells pancreatiche -Alcuni studiosi suggeriscono l’esistenza di progenitori, localizzati nelle isole pancreatiche, capaci di proliferare e differenziare in cellule beta -Espressione nelle isole di putativi stem- progenitor cells markers

Markers putativi dei progenitori pancreatici ●PDX1 ●Ormone pancreatico YY ●Tirosina idrossilasi ●Acido Beta-galattosidasi ●NGN3 ●Nestina ? ●Citocheratine

RT-PCR per i markers dei precursori neuronali e pancreatici Immunostaining: co-espressione di nestina e PDX-1

Le colonie PMP generano tutte le linee cellulari neuronali neuroni astrociti oligodendrociti

Le colonie PMP generano cellule Beta pancreatiche

Le colonie PMP generano isole endocrine e cellule esocrine Acini pancreatici Cellule pancreatiche stellari

Liver Stem Cells and Prospects for Liver Reconstitution by Transplanted Cells HEPATOLOGY, February 2006

Liver stem cells -Ci sono diverse evidenze sulla presenza di stem cells-progenitori nel fegato fetale -L’esistenza di tali cellule nel tessuto adulto rimane ancora da stabilire -Dove risiedono?

The liver stem cells niche Migliore candidato per la nicchia delle stem cells del fegato: canale di Hering

Oval cells -Popolazione eterogenea di cellule che proliferano sotto condizioni fisiopatologiche. -In questa popolazione sono presenti cellule che esprimono uno o più marcatori ematopoietici staminali: c-kit, CD34, Sca-1, Thy-1. Probabile origine da HSC? -Le cellule ovali “attivate” esprimono: markers specifici delle cellule epiteliali biliari (CK-7, 8, 18, 19, OV-6) markers degli epatoblasti fetali immaturi (AFP, GGT, piruvato chinasi) -Le cellule ovali “attivate” sono in stretto contatto con le cellule stellate del fegato le quali secernano fattori di crescita necessari per la loro crescita e proliferazione

Cellule staminali epatiche durante lo sviluppo embrionale -ED 8: le cellule staminali dell’endoderma iniziano a proliferare e differenziare -ED 8,5-9,5: specificità verso la linea epiteliale epatica; richiesta di segnali mesodermici (fibroblast growth factor) e mesenchimali (bone morphogenetic protein) -ED 11-15: rapida espansione degli epatoblasti -ED 16: fase di “commitment”: divergenza degli epatoblasti in due diverse linee cellulari. Il differenziamento in epatociti è regolato da HGF (hepatocyte growth factor) e da OSM (oncostatina M) laddove il differenziamento in colangiociti è regolato da notch