Struttura della membrana batterica e LPS PROCESSO ELETTROFORETICO

PRODUCONO: SAGGIO COLORIMETRICO DI HANS CHRISTIAN JOACHIM SI DIVIDONOIN PRODUCONO:

Struttura dell’LPS Lipide A A fronte di una diversità strutturale che caratterizza i lipopolisaccaridi presenti nei diversi batteri essi condividono una comune architettura generale. Infatti gli LPS sono composti da tre domini strutturali chimicamente,geneticamente e biologicamente distinti legati covalentemente tra loro Lipide A Il lipide A è la porzione lipofilica dell’ LPS preposta all’ancoraggio dell’intera macromolecola alla membrana esterna batterica. Consiste di un disaccaride formato da due residui di 2-glucosammina 2-ammino-2-desossi-glucopiranosio.

Core Il Core è un complesso oligosaccaridico che si divide in due regioni: Core interno e Core esterno. Esso è collegato al lipide A attraverso l’ossidrile primario in pos.6’ della GlcN che è impiegato in un legame α-chetosidico con uno zucchero tipico del Core interno . il KDO. Data la particolare labilità questo legame è fortemente idrolizzabile e ciò viene sfruttato come efficace metodo di separazione del lipide-A dal resto della molecola Il Core esterno , chiamato anche regione degli esosi ,è composto da pochi residui glicosidici(5-10 monosaccaridi) zuccheri neutri , acidi uronici ed amminozuccheri

O-Chain L’ O-Chain è la componente polisaccaridica della macromolecola ed è direttamente legata al Core. Le sue notevoli dimensioni lo rendono la porzione dominante di tutta la molecola lipopolisaccaridica che può raggiungere pesi molecolari dell’ordine di 100 kDa. Esso costituisce il dominio idrofilico e costituisce il determinante antigenico dell’LPS, e cioè Ia parte responsabile dello specifico riconoscimento antigene-anticorpo. Infatti nell’ ambito dello stesso ceppo batterico (es. salmonella) la presenza di un alto numero di LPS differenti e da attribuirsi al diverso contenuto di monosi dell’ o-chain

Domini strutturali dell’LPS A ) LPS più membrana esterna B) Schema dell’LPS

Per risalire all’LPS che costituisce la parte integrante della membrana esterna dei batteri Gram-negativi e’ per tanto necessario isolare la membrana dagli altri componenti dei batteri.La fase successiva e’ l’isolamento dell’LPS dall’LOS tramite dialisi e metodi cromatografici.

Processo di taratura e utilizzo della bilancia analitica per la pesatura

Preparazione della composizione necessaria alla attuazione della fase fenolica

Per centrifugazione si separa il residuo cellulare(pellet)dal surnatante che contiene il lipoolisaccaride.Il LOS viene precipitato con acqua\fenolo al 90% per 68 º per 1 ora per permettere l’estrazione dell’LPS. Il sistema mantenuto a temperatura per un ora subisce la suddivisione in fase acquosa fenolica e un interfase solida costituita da materiale cellulare

Cella elettroforetica Le tecniche cromografiche piu’ utilizzate sono la cromatografia ad esclusione molecolare(gel filtrazione)e la cromatografia a scambio ionico. vasca elettroforetica

Esempio di migrazione elettroforetica di una soluzione ionica Esempio di migrazione elettroforetica di una soluzione ionica. Le particelle cariche positivamente migrano verso il polo negativo e viceversa. A seconda delle dimensioni le particelle si dispongono in zone diverse del gel: le più grandi più vicine ai pozzetti di caricamento e le più piccole più avanti. Per il sequenziamento bisogna effettuare una elettroforesi ad alta risoluzione, ed essere svolta sempre in condizioni denaturanti. Per questo procedimento possiamo usare l'elettroforesi su gel. L’elettroforesi che è una metodologia di laboratorio che viene utilizzata per la separazione di molecole cariche in soluzione che migrano in modo differente in un campo elettrico in base al loro rapporto carica/massa e alla loro forma.  Inoltre molecole con carica simile ma di diverso peso molecolare, e quindi con un diverso rapporto q/m, presentano una migrazione differenziale se sottoposte ad un campo elettrico.

Gel ottenunto dal processo elettroforetico immerso nel fissante

L’elettroforesi sul gel policriliammide 12% con sodio attesta la presenza dell’LPS ,in cui è presente la tipica mobilità di migrazione a gradini che caratterizza queste macromolecole . In seguito per l’analisi della porzione glucidica costituente LPS .Il polisaccaride è scisso nei diversi monosi che sono interamente acetitati al fine di analizzare la GC-MS