Estrazione ed analisi dei lipidi Lezione del 17- 5- 07

in soluzione fisiologica Estrazione dei lipidi (Bligh & Dyer) CELLULE o MEMBRANE in soluzione fisiologica + CH3OH Agitazione per 15’ SISTEMA MONOFASICO + CHCl3 H2O/CH3OH/CHCl3 0,8 2 1 Agitazione per 15’ centrifuga

+ + CH3OH+H2O SISTEMA BIFASICO CHCl3 ESTRATTO LIPIDICO SN1 H2O /CH3OH/ CHCl3 0,8 2 1 pellet centrifuga SN2 CHCl3 + H2O + CH3OH+H2O CH3OH / CHCl3 / H2O 1 1 0,9 SISTEMA BIFASICO SN1+SN2 CHCl3 ESTRATTO LIPIDICO

Cos’e’ la Cromatografia ? La cromatografia e’ una tecnica che serve a separare i singoli componenti di una miscela omogenea. E’ basato sulla diversa ripartizione di molecole tra una fase mobile (liquida o gassosa) ed una fase stazionaria (solida o liquida) Analisi qualitativa Analisi quantitativa Purificazione Miscela Componenti

Differenti tipi di cromatografia Cromatografia liquida ( cromatografia su colonna, su strato sottile o TLC, e HPLC) Fase stazionaria: gel di silice, allumina, etc. Fase mobile: solventi organici importanti proprieta’: polarita’ Gas cromatografia Fase stazionaria: un polimero impaccato o capillare. Fase mobile: gas inerte (Elio) importanti proprieta’: punto di ebollizione (evaporazione soluti)

Cromatografia su strato sottile (TLC) Il gel di silice o di allumina (fase stazionaria) e’ deposto in strato sottile su una lastra di vetro. La silice e’ molto polare. La superficie dei granuli di silice è caratterizzata dalla presenza di gruppi silanolici (Si-OH) e di gruppi silossanici (Si-O-Si). Sui primi ha luogo l’interazione tra fase fissa e soluto La silice è resa attiva dai gruppi silanolici ≡Si-OH. Questi, però, sono bloccati da molecole di acqua legate mediante legami idrogeno

Quindi, è necessario essiccare in stufa ( 180 °C) per eliminare le molecole di acqua, senza però superare i 300 °C, perché si avrebbe la condensazione interna con formazione nuovamente di gruppi silossanici La fase mobile dovrà avere caratteristiche tali da competere, con il soluto, per l’adsorbimento sulla fase stazionaria. L’effetto della fase mobile è quello di differenziare la capacità dei vari soluti di essere adsorbiti. Un soluto molto polare interagisce fortemente con la fase fissa e, per far si che la fase mobile competa con il soluto, dovra’ anch’essa essere abbastanza polare.

fosfolipidi R1, R2= catene acidi grassi non polari Affinità di classi di composti con fasi stazionarie polari   Composto Gruppo funzionale forza di assorbimento crescente Acidi Alcoli Ammine Mercaptani Aldeidi Chetoni Esteri Eteri Alcheni Alcani fosfolipidi R1, R2= catene acidi grassi non polari Glicerolo, gruppi fosfato e X = parte polare

Fosfatidiletanolammina H 3 + O - P 2 C R ' R O C H 2 ' P - N 3 + Fosfatidilserina Fosfatidilcolina C H 2 O - P R ' N + ( 3 ) H Fosfatidilinositolo C 2 O - P R '

Cromatografia su strato sottile (TLC) Applicazione del campione Corsa cromatografica Visualizzazione Interpretazione dei risultati

1. Applicazione del campione A. Disegnare la linea di deposizione e il fronte del solvente con una matita  1 cm. “fronte del solvente” B. Risospendere i campioni in cloroformio C. Depositare il campione mediante capillari o siringhe tipo Hamilton “linea di deposizione”  1 cm.

2. Corsa cromatografica } Camera di slivuppo A. La lastra viene posta in una vaschetta chiusa saturata dai vapori del solvente di sviluppo Lastra cromatografica B. Il campione viene trasportato attraverso la fase stazionaria C. Rimuovere la lastra dalla cameretta quando il solvente ha raggiunto la linea superiore } Solvente di sviluppo (fase mobile) Camera di slivuppo

3. Visualizzazione dei risultati A. Attendere l’evaporazione del solvente dalla superficie della lastra B. Per rilevare la posizione dei componenti esistono metodi chimici e metodi fisici C. Un metodo fisico si basa sull’osservazione della lastra alla luce ultravioletta (254 nm 365 nm). I metodi chimici consistono nello spruzzare sulla lastra reagenti cromogeni come soluzioni di H2SO4, di iodio, blu di molibdeno ecc..

4. Interpretazione dei risultati A. Determinare il fattore di ritenzione (Rf) per ciascuna macchia. distanza tra macchia e linea di deposizione distanza tra il fronte del solvente e linea di deposizione Rf = d S dA dS ? Rf componente A = Rf componente B = - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 dB dS ? - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 d c d B B. I componenti incogniti vengono identificati per confronto con gli Rf degli standard . ? - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 3 d A miscela std std std incognita

- polare! + polare! Fronte del solvente Corsa cromatografica Miscela B A t Corsa cromatografica Fronte del solvente Linea di deposizione Miscela incognita I componenti meno polari presentano una minore interazione con la silice e migrano piu’ velocemente I componenti piu’ polari stabiliscono maggiori interazioni con la silice e migrano piu’ lentamente I componenti neutri migrano con il fronte del solvente

TLC preparativa (purificazione dei singoli componenti) Scraping della silice Estrazione dei lipidi (Bligh & Dyer)

Analisi quantitativa