Tecniche della Biologia Molecolare Amaldi Cap 21 (vari paragrafi) Allison Cap 8 e 9 (vari paragrafi)

Uso di sonde di DNA per l’identificazione e l’analisi di sequenze nucleotidiche Ibridazione A saturazione Ibridazione in situ o citologica Southern e Northern Blot Ibridazione su colonia o su placca Microarray (o microchip)

Ibridazione in situ o citologica

Microarray

Microarray

Tecnologie di base per l’isolamento e la manipolazione dei geni Ingegneria genetica o Tecnologia del DNA ricombinante Enzimi di restrizione e DNA Ligasi Vettori di clonaggio Plasmidi Trasformazione di cellule di E. coli e selezione dei trasformanti Plasmidi della serie pUC: selezione blu bianco Vettori di espressione e produzione di proteine ricombinanti Batteriofago Lamda Cosmidi Vettori per il clonaggio e l’espressione in cellule eucariotiche Vettori di lievito Vettori per il trasferimento genetico in cellule animali Trasferimento di DNA all’interno di Vegetali

Clonaggio

Enzimi di restrizione e DNA Ligasi

Vettori di Clonaggio Plasmidi Cosmidi Fagi Cromosomi artificiali: Lievito (YAC) Batterici (BAC) Plasmidici (PAC) Vettori di espressione in Procarioti, Eucarioti, Piante Virus

Vettori di Clonaggio

Plasmidi della serie pUC: selezione blu bianco

Vettori di Espressione: E.Coli

Batteriofago Lamda

Cosmide

Vettori di Lievito: vettori plasmidici

Vettori di Lievito: YAC

Banche di DNA – DNA library Banche genomiche Rappresentatività di una libreria di DNA genomico Libreria di cDNA Identificazione del clone contenente il DNA di interesse da una libreria

PCR – Reazione a catena della polimerasi Polymerase Chain Reaction (Mullis, 1983) Taq Polymerase Ciclo di PCR: Denaturazione del DNA Associazione (Annealing) degli inneschi (primer) Sintesi da parte della polimerasi

Ciclo di PCR: Denaturazione del DNA: 30 sec a 95° Associazione (Annealing) degli inneschi (Primer) 30 sec a 40-60°C per favorire l’associazione specifica degli inneschi (La temperatura deve essere di circa 5°C al di sotto della Tm degli inneschi) Sintesi da parte della polimerasi: 2 min a 72°C che è la temperatura ottimale per la Taq polimerasi

RT-PCR & Real Time PCR RT-PCR = PCR su un campione di DNA retrotrascritto a partire da RNA mediante Reverse Transcriptase Real Time PCR = PCR in tempo reale, per l’analisi degli amplificati (quantità) durante l’amplificazione,

Real Time PCR

Determinazione della sequenza nucleotidica del DNA Metodo chimico (Maxam & Gilbert) Metodo enzimatico (Sanger)

Principio del seq

Metodo chimico - Maxam & Gilbert

Metodo enzimatico - Sanger

piattaforme di sequenziamento di nuova generazione - NGS In Uso Tecnologia 454 – 454 Genome Sequencer FLX di Roche Piattaforma Illumina – Genome Analyzer Sistema SOLiD – Applied Biosystem Altre Helicos Biosciences ION Torrent

Tecnologia 454 – 454 Genome Sequencer FLX di Roche

Piattaforma Illumina – Genome Analyzer

Sistema SOLiD – Applied Biosystem

Campi applicazioni NGS Sequenziamento de novo e risequenziamento di genomi complessi Identificazione di siti polimorfici e mutazioni Analisi del trascrittoma Studio dell’Interazione DNA- Proteine Caratterizzazione del metiloma e studio dell’editing Metagenomica

21.9 Valutazione dell’espressione di un gene

21.10 Inibizione dell’espressione di geni specifici RNA antisenso Intereferenza da RNA