I parametri NMR Accoppiamento scalare Il rilassamento Il chemical shift Accoppiamento scalare La intensità dei segnali Il rilassamento

Costanti di accoppiamento

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare 2J 3J 3J

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare 1H

Accoppiamento scalare 1H

Accoppiamento scalare b b a a 13C 1H S I

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare omonucleare 3J HNHa 2J HbHb

Accoppiamento scalare 2J 3J 3J

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

Sistemi di spin A2X3

Combinando insieme accoppiamenti diversi

Sistema AMX Acetato di vinile

Sistema AMX ACETATO DI VINILE

Sistemi di spin A2X3

Combinando insieme accoppiamenti diversi

Costante di accoppiamento scalare 2 spin sono accoppiati per effetto di una interazione elettronica, ovvero per effetto di un legame chimico Questi effetto è generalmente osservabile per nuclei che distano fino a 3 legami sigma. Il fenomeno dell’accoppiamento scalare si esprime attrvaerso una constante di accoppiamento J Es HN-Ha 3J = 3-10 Hz LA costante di accoppiamento scalare ha come effetto la formazione di un doppietto. Ovvero ogni spin non appare come un singolo picco ma come un doppietto, le cui componenti sono separate in Hertz, dalla costante di accoppiamento 3-10 Hz

Accoppiamento scalare e rilassamento T2 La larghezza di riga di un segnale NMR dipende dalle proprietà di rilassamento T2. In prima approssimazione, il T2 dipende a sua volta dalle dimensione della molecola studiata. Piu’ la molecola è grande, piu’ il T2 è corto e piu’ i segnali sono larghi 3-10 Hz 15 Hz MW ca. 5000 In una proteina, la larghezza di riga di un Hn o di un Ha è tipicamente maggiore di 10 Hz, ovvero della separazione del doppietto. In queste condizioni, l’accoppiamento scalare non da luogo a doppietti osservabili 20-35 Hz MW. 10-20000

N

Importante 3J dipendono dall’angolo diedro INFORMAZIONE STRUTTURALE IMPORTANTE PER RISOLVERE LE STRUTTURE

3JHNHa= Acos2f + B cosf +C

Costanti di accoppiamento in sistemi uniformemente arricchiti in 13C ed in 15N

Costanti di accoppiamento 3J Razionale Strategia La misura quantitativa di una costante d’accoppiamento 3J fornisce informazioni sul valore dell’angolo diedro coinvolto, ovverosia fornisce una informazione strutturale diretta Le costanti di accoppiamento scalare sono, da un punto di vista quantitativo, dipendenti dall’angolo diedro sotteso tra i quattro atomi coinvolti ESEMPIO: 3JHnHa 3-6 Hz in a eliche 9-12 Hz in foglietti b H C C H

Costanti di accoppiamento The scheme of 1J scalar couplings

Rilassamento

It can be observed directly in the FID (linewidth) T1 and T2 T1 describes the time evolution of magnetization in the z axis. This can only be observed if a final 90° pulse is applied to rotate the magnetization from the z axis to the xy plane. The intensity of the overall magnetization on the z axis is related to the overall energy of the system . i.e. the populations of ground and excited states The intensity of the magnetization on the xy axis is related to the rate of dephasing of the magnetization. T2 describes the time evolution of magnetization in the xy plane, where acquisition takes place. It can be observed directly in the FID (linewidth)

x -y z B0 A Pulse p x x -y z B0 A Pulse p x B1 x -y z B0 A Pulse p x DE x -y z B0 A Pulse p x B1 x -y z B0 A Pulse p x B1 x -y z B0 A Pulse p x x -y z B0 A Pulse p x x -y z B0 A Pulse E DE x -y z B0 A Pulse p x x -y z B0 A Pulse p x x -y z B0 A Pulse p x B1 x -y z B0 A Pulse p x B1 p x A Pulse E DE z B0 -y B1 x

Rilassamento Il sistema reagisce alla perturbazione applicata per tornare all’equilibrio Rilassamento T1 La constante di velocità con cui la magnetizzazione ritorna all’equilibrio

T1 T1 describes the time evolution of magnetization in the z axis. Related to the overall energy of the system The populations of ground and excited states

x -y z B0 A Pulse p/2 x receiver x -y z B0 A Pulse p/2 x receiver x -y DE z B0 -y B1 x

Rilassamento Il sistema reagisce alla perturbazione applicata per tornare all’equilibrio Rilassamento T2 La constante di velocità con cui la magnetizzazione scompare dal piano xy My=exp(-t/T2)

T2 T2 describes the time evolution of magnetization in the XY plane. In addition to the exchange of energy with the environment, nuclei exchange energy one with another. This does NOT affect the energy of the system but contributes to relaxation T2 is alwayes shorter or equal to T1. It can be observed directly in the FID (linewidth)

z y x M B1 90° t wI I t

The NMR spectrum FID Spectrum The Fourier Transform of the FID provides the NMR spectrum Spectrum ½ Fmax(w) wI w1 w

Da ricordare INOLTRE…… La larghezza di riga di un segnale dipende dal valore del tempo di rilassamento T2. Tanto piu’ T2 é lungo, ovvero tanto piu’ il sistema impiega tempo per tornare allo stato di equilibrio, tanto piu’ la riga NMR é stretta. Una riga stretta permette al segnale di essere osservato con maggiore accuratezza INOLTRE……

Da ricordare Se un segnale ha un T2 molto piccolo, sarà impossibile osservare gli accoppiamenti scalari perché il sistema rilassa “durante” la osservazione dell ‘effetto.

I Meccanismi di rilassamento

Campi Magnetici Oscillanti

Anisotropia dello Spostamento Chimico (CSA)

Velocità di Rilassamento 15N in Calbindin D9K

Moti in Scala ns-ps del Citocromo b5 (Fe3+) Aumenta Mobilità

Moti in Scala ns-ps del Citocromo b5 (Fe2+) Aumenta Mobilità

I parametri NMR Il chemical shift La intensità dei segnali Accoppiamento Scalare Il rilassamento Accoppiamento Dipolare

Accoppiamento scalare Accoppiamento dipolare

Accoppiamento Dipolare mJ B0 mI q r

Accoppiamento Dipolare Due spin vicini nello spazio, interagiscono in misura inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza. Questo effetto è anche chiamato effetto NOE (Effetto Overhauser nucleare). mJ B0 mI q r

Accoppiamento Dipolare Due spin vicini nello spazio, interagiscono in misura inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza. Questo effetto è anche chiamato effetto NOE (Effetto Overhauser nucleare). mJ B0 mI q r Per effetto della dipendenza dalla sesta potenza, si tratta di un effetto che è molto importante quando i due spin sono vicini e che diventa trascurabile quando la distanza aumenta.

Accoppiamento Dipolare Due spin vicini nello spazio, interagiscono in misura inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza. Questo effetto è anche chiamato effetto NOE (Effetto Overhauser nucleare). mJ B0 mI q r L’importanza di questo accoppiamento è enorme, perché se io riesco a misurare questo effetto, ottengo una informazione quantitativa sulla distanza.

Accoppiamento dipolare A differenza dell’accoppiamento scalare, l’accoppiamento dipolare altera la popolazione dei livelli del sistema e non i valori di energia Da un punto di vista fisico, é l’accoppiamento tra due “magneti” che sono vicino nello spazio

Accoppiamento dipolare Reference experiment Saturation of signal S

Accoppiamento dipolare L’accoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia L’entità dell’effetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, l’accoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A. NON si osservano doppietti L’accoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin all’altro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE Nuclear Overhauser Effect Aumenta la intensità di B Perturbo A

Accoppiamento dipolare L’accoppiamento dipolare è “indipendente dall’accoppiamento scalare 2 spin possono essere accoppiati : -Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici -scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio -dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici L’effetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale , detto NOESY (in realtà si puo’ anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero’ non parleremo Pensate a degli esempi, per favore

Accoppiamento scalare ed accoppiamento dipolare L’accoppiamento scalare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono legati da legami chimici (THROUGH BOND) E’ l’accoppiamento tra spin determinato dagli orbitali molecolari, ovvero le energie dei livelli di spin nucleari sono interdipendenti Porta alla formazione di doppietti e multipletti. Puo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, sfruttando il trasferimento atraverso legami chimici L’accoppiamento dipolare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono vicini nella spazio (THROUGH SPACE) E’ l’accoppiamento tra due dipoli magnetici che sono vicini tra di loro Puo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, in funzione della loro prossimità spaziale

Through space AND throuhg bonds Through bond

Ricapitolando Cosa sappiamo sulle informazioni ottenibili via NMR che possono darci informazioni strutturali