Sessione di Laurea Novembre 2015 Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Laurea Triennale in Scienze Biologiche Curriculum cellulare-applicativo Epigenetic screening as strategy to highlight new putative cancer genes in a model of RTK-driven tumorigenesis Candidato: Marta Mastrogiovanni Relatore interno: Prof.ssa Ada Maria Tata Relatore esterno: Dott.ssa Marίa Arechederra Sessione di Laurea Novembre 2015

Complessità delle vie di segnalazione cellulare Recettori accoppiati a proteine G Recettori citochine Recettori RTK Recettori TGFβ Recettori Hedgehog Recettori Wnt Recettori Notch 26 Novembre 2015

RTK: recettori tirosin-chinasici Recettore c-Met C-Met è espresso dalle cellule epiteliali di molti organi (fegato, pancreas, prostata, rene, muscoli e midollo osseo) sia durante l’embriogenesi che in età adulta. L’attivazione di c-Met mediata da HGF è stata denominata “crescita invasiva” e consiste in una serie di processi cellulari che occorrono sia in condizioni fisiologiche che patologiche. “c-MET pathway inhibitors for cancer therapy: progress and challenges” (Liu et al., 2010). Aumentata o sregolata attivazione dell’asse di HGF/c-Met TUMORIGENESI 26 Novembre 2015

TUMORIGENESI Sovra-attivazione di c-Met La tumorigenesi è il processo di trasformazione di cellule NORMALI in cellule CANCEROSE “The Hallmarks of Cancer” Hanahan and Weinberg, 2000 Resistenza all’apoptosi Potenziale replicativo illimitato Autosufficienza rispetto a fattori di crescita Perdita di sensibilità rispetto a fattori inibenti la crescita Abilità di invadere tessuti vicini e formare metastasi Induzione dell'angiogenesi Tumori umani del seno della prostata della tiroide gastrico del colon retto del pancreas del rene ovaie e utero osteosarcoma Sovra-attivazione di c-Met + Una sovra-espressione del recettore chinasico c-Met è riscontrata nel 20-48% dei casi di Carcinoma Epato-Cellulare (HCC), la forma più comune di tumore epatico. 26 Novembre 2015

Costruzione modello murino con over-espressione di c-Met Il 45% dei topi con sovra-espressione di c-Met ha sviluppato Carcinoma Epato-Cellulare (HCC) 26 Novembre 2015

Analisi funzionale dei loro ruoli come oncogeni o oncosoppressori OBIETTIVI Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo di Carcinoma Epato-Cellulare con accentuazione di c-Met Analisi funzionale dei loro ruoli come oncogeni o oncosoppressori STRATEGIA EPIGENETICA TEST IN VIVO E IN VITRO 26 Novembre 2015

Tutti uguali, Tutti diversi Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo di Carcinoma Epato-cellulare con accentuazione di c-Met EPIGENETICA FENOTIPO GENOTIPO L’Epigenetica comprende tutti quei fenomeni ereditabili che sono coinvolti nell’attività di regolazione genica senza alterazione della sequenza genica. Il cambiamento epigenetico è un evento NORMALE e NATURALE, essenziale per lo SVILUPPO, per l’IMPRINTING GENOMICO, per il mantenimento della STABILITA’ GENOMICA e per il DOSAGGIO GENICO. L’Epigenetica rappresenta l’interfaccia tra ambiente e genoma: può essere influenzata da diversi fattori tra cui l'età, lo stile di vita e l’insorgenza di malattie. Le modifiche sono a carico del DNA (senza alterarne il significato) o delle proteine con le quali il DNA interagisce nella formazione della cromatina: gli istoni. Tutti uguali, Tutti diversi 26 Novembre 2015

Caratterizzazione delle coppie di oligonucleotidi Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo di Carcinoma Epato-cellulare con accentuazione di c-Met Caratterizzazione delle coppie di oligonucleotidi 26 Novembre 2015

DIFFERENZA DI METILAZIONE DIFFERENZA DI ESPRESSIONE Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo di Carcinoma Epato-cellulare con accentuazione di c-Met DIFFERENZA DI METILAZIONE DIFFERENZA DI ESPRESSIONE 26 Novembre 2015

Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo di Carcinoma Epato-cellulare con accentuazione di c-Met Dai risultati ottenuti è possibile evidenziare due anomalie principali : Nonostante il pattern di metilazione sia estremamente modificato tra tumore e tessuto sano, l’espressione del 30% dei geni non appare alterata. A un 80% di casi di iper-metilazione non corrisponde un’attesa down-regolazione: i risultati dimostrano invece che il 92% di questi geni è over-espresso. 26 Novembre 2015

Analisi funzionale dei loro ruoli come oncogeni o oncosoppressori Studio dei fenotipi: sano vs tumorale 26 Novembre 2015

Studio dei fenotipi: sano vs tumorale Analisi funzionale dei loro ruoli come oncogeni o oncosoppressori Studio dei fenotipi: sano vs tumorale 26 Novembre 2015 Pagina 12

Condizione aderente: Collagene Fissativo: Methanol-Acetone. 1. Caratterizzazione degli Epatociti sani tramite RT-qPCR e IMMUNO STAININGS Primary Hepatocytes Condizione aderente: Collagene Fissativo: Methanol-Acetone. Rosso: α-Fetoprotein Blu: nuclei 26 Novembre 2015

2. Analisi del fenotipo tumorale tramite SOFT AGAR mHCC1 mHCC3 26 Novembre 2015

Perdere la memoria per guadagnare una nuova vita Conclusioni L’accentazione di c-Met influisce sulle modificazioni epigenetiche in Carcinoma Epato-Cellulare murino: alla modificazione della metilazione del Dna, non corrisponde però una lineare e contraria modificazione dell’espressione genica. Per comprendere il ruolo dei geni come possibili oncosoppressori o oncogeni nella tumorigenesi del Carcinoma Epato-Cellulare, sono stati caratterizzati due sistemi cellulari: linee cellulari mHCC ed epatociti SV40-immortalizzati. Il grado di espressione di solo 14 geni sembra riflettere coerentemente il livello di modificazione nella metilazione del DNA. Gran parte dei geni risponde in maniera anomala a un differente pattern di metilazione: è necessario comprendere se essi sono effettivamente coinvolti nel processo tumorigenico e/o se intervengono altri meccanismi di regolazione. Epigenetica come strategia per scopi diagnostici e/o terapeutici Perdere la memoria per guadagnare una nuova vita Odissea nello spazio Stanley Kubrick, 2001 Controllare/modificare l’epigenoma per permettere alla cellula di riscrivere la propria storia 26 Novembre 2015

Dott.ssa Marίa Arechederra GRAZIE a.. Dott.ssa Marίa Arechederra Prof. ssa Ada Maria Tata TerribleGang GRAZIE a.. Marίa Arechederra Ada Maria Tata Equipe TerribleGang Marsiglia, 2015 Sessione di Laurea Novembre 2015