Colture vegetali in vitro come sistema biotecnologico per la produzione di composti bioattivi  Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Corso di laurea triennale in Scienze Biologiche Candidata: Giovanna Monticelli Relatore: Alessio Valletta Roma 26 Novembre 2015 1

METABOLITI VEGETALI DI INTERESSE INDUSTRIALE Metaboliti farmacologicamente attivi Metaboliti per ottenimento di energia Cyanobacteria Datura stramonium Chlorophyta Nel mio lavoro di tesi ho analizzato l’importanza dei metaboliti secondari vegetali, utili in ambito farmaceutico ed energetico, ottenuti mediante strategie biotecnologiche, in particolare le colture in vitro. Considerati a lungo prodotti di scarto, oggi sappiamo che i metaboliti secondari sono indispensabili per la sopravvivenza delle specie in quanto giocano un ruolo importante come segnali chimici nell’interazione della pianta con l’ambiente biotico (microrganismi, piante, animali) e sono anche implicati nella protezione da fattori abiotici (temperatura, UV, carenza di acqua e nutrienti minerali). Tra i metaboliti farmacologicamente attivi troviamo l’iosciamina, un alcaloide appartenente al genere Datura stramonium. Tale alcaloide è un antimuscarinico, che agisce bloccando l’azione dell’acetilcolina a livello del sistema nervoso parasimpatico (muscolatura liscia) e a livello del sistema nervoso centrale. Nell’ultimo decennio, la ricerca ha visto protagonisti i metaboliti secondari anche da colture in vitro di microalghe. Esistono più di 50.000 specie di microalghe raggruppabili in procariote (Cyanobacteria), eucariote (Chlorophyta) e diatomee (Bacillariopyta) caratterizzate da un elevato contenuto lipidico, fondamentale per l’ottenimento di metaboliti energicamente attivi. Bacillariopyta Formula di struttura dell’iosciamina Colture vegetali in vitro come sistema biotecnologico per la produzione di composti bioattivi

TECNICHE PER LA PRODUZIONE DI METABOLITI SECONDARI ESPIANTI ELICITORE ABIOTICO Ultrasuoni CALLO SOSPENSIONI CELLULARI ELICITATE ELICITORE BIOTICO Per avviare una coltura in vitro è necessario ottenere dei frammenti, detti espianti, dal corpo della pianta. Tali espianti vengono posti nel mezzo colturale dove possono formare, in corrispondenza delle superfici di taglio, masse di tessuto cicatriziale definite calli. I calli vengono subcolturati ogni 20 giorni circa, rinnovando il terreno, aggiungendo vari fitormoni o additivi organici per stimolarne la crescita e la proliferazione del callo. Per la produzione su larga scala, vengono utilizzate le sospensioni cellulari, ottenute inoculando i calli friabili in mezzo colturale liquido. Tale tecnica risulta molto utile per il sistema bifasico: un sistema in cui le cellule vengono prima coltivate in condizioni favorevoli alla produzione di biomassa (affinché si ottenga una crescita esponenziale) e poi trasferite in un mezzo favorevole alla produzione del metabolita secondario di interesse. Un vantaggio di questo sistema a due fasi è la possibilità di addizionare al mezzo di coltura precursori ed elicitori proprio nella fase in cui la produzione di metaboliti secondari è al suo massimo. Un elicitore è una sostanza che, quando introdotta a basse concentrazioni nel mezzo di coltura, inibisce o aumenta la biosintesi di composti specifici e l’elicitazione è un processo di induzione o potenziamento della biosintesi dei metaboliti secondari vegetali. In base alla loro origine, possono essere classificati in abiotici(di tipo chimico o fisico come gli ultrasuoni) e biotici (come polisaccaridi, microrganismi e glicoproteine, ottenuti ad esempio dal fungo Rhizopus stolonifer). Rhizopus stolonifer METABOLITI SECONDARI Colture vegetali in vitro come sistema biotecnologico per la produzione di composti bioattivi

COLTURE DI Taxus baccata COLTURE ETEROTROFICHE ALGALI SPECIE DI INTERESSE COLTURE DI Taxus baccata COLTURE ETEROTROFICHE ALGALI Chlorella protothecoides Acido linoleico Grazie a queste tecniche è stato possibile portare avanti lo studio della produzione di metaboliti secondari di diverse specie di interesse. Io, in particolare, mi sono occupata della produzione in vitro di taxani dalla specie Taxus baccata e anche di alcune colture eterotrofiche algali impiegate nella produzione di biodiesel, grazie alla loro elevata produttività di acidi grassi. Taxolo Acido docosaesenoico Colture vegetali in vitro come sistema biotecnologico per la produzione di composti bioattivi

…anche la semi-sintesi chimica risulterebbe troppo dispendiosa!!! SPECIE DI INTERESSE COLTURE DI Taxus baccata Il taxolo è una molecola complessa… MECCANISMO D’AZIONE Inibisce la depolimerizzazione della tubulina, provocando il blocco della mitosi, e impedisce così la proliferazione delle cellule tumorali Il genere Taxus ha, da sempre, suscitato un notevole interesse, grazie al suo contenuto di alcaloidi, in particolare il taxolo (noto anche come paclitaxel) importante per le sue proprietà antitumorali. Il taxolo inibisce la proliferazione delle cellule legandosi ai microtubuli, alla subunità beta della tubulina, promuovendo così la sua polimerizzazione. Dal momento che per produrre un solo chilogrammo di taxolo è necessario prelevare 10000 kg di corteccia, vi è la necessità di trovare fonti alternative per la sua produzione. Oltre alle riserve naturali e alla sintesi chimica, nel 2007 è stato brevettato un nuovo processo per semisintesi del taxolo a partire dalla 10 deacetilbaccatina III. Questo processo è meno complicato della sintesi chimica, ma è ancora molto costoso. …anche la semi-sintesi chimica risulterebbe troppo dispendiosa!!! Colture vegetali in vitro come sistema biotecnologico per la produzione di composti bioattivi

SOSPENSIONI CELLULARI ELICITATE SPECIE DI INTERESSE COLTURE DI Taxus baccata METABOLITI SECONDARI SOSPENSIONI CELLULARI ELICITATE CALLO ESPIANTI Un metodo alternativo ed ecosostenibile per la produzione di taxolo è rappresentato proprio dalle colture cellulari vegetali. Questa metodica presenta molti vantaggi rispetto alla sintesi chimica, ad esempio la possibilità di coltivare le cellule indipendentemente dalla loro originale provenienza, senza dover tenere conto delle fluttuazioni stagionali. Un’altra strategia molto importante oltre alle sospensioni cellulari, è l’immobilizzazione cellulare. Con questa tecnica è possibile ottenere un’alta concentrazione di cellule per unità di volume. Le cellule vegetali vengono immobilizzate utilizzando diversi gel come l’alginato o la poliacrilammide e si è osservato, come l’utilizzo di alginato di calcio per l’immobilizzazione di cellule produttrici di paclitaxel e baccatina III ne ha migliorato la produzione, rispetto alle cellule in sospensione. Per incrementare ancora di più la produzione di taxani ed arrivare ad una produzione a livello industriale, si è ricorsi all’uso di bioreattori. CELLULE IMMOBILIZZATE BIOREATTORE Colture vegetali in vitro come sistema biotecnologico per la produzione di composti bioattivi

COLTURE DI Taxus baccata SPECIE DI INTERESSE COLTURE DI Taxus baccata WAVE Non convenzionale, con agitazione ad onda STIRRED AIRLIFT In particolare furono utilizzati bioreattori STIRRED, AIRLIFT E WAVE. Il bioreattore STIRRED è un bioreattore convenzionale ad agitazione meccanica dovuta a delle pale rotanti poste centralmente, mentre AIRLIFT e WAVE non sono convenzionali e il primo è ad agitazione per circolazione d’aria, dove appunto un flusso di aria compressa sterile fluisce dal basso verso l’alto, il secondo con agitazione ad onda generata dall’oscillazione del piano d’appoggio. Convenzionale, ad agitazione meccanica Non convenzionale, ad agitazione per circolazione d’aria Colture vegetali in vitro come sistema biotecnologico per la produzione di composti bioattivi

BIOREATTORE STIRRED SPECIE DI INTERESSE COLTURE DI Taxus baccata Contenuto di PACLITAXEL in cellule immobilizzate: 43,43 mg/L a 16 giorni Contenuto di BACCATINA III in cellule immobilizzate: 5,06 mg/L a 8 giorni Partendo da cellule in sospensione e da cellule immobilizzate con alginato di calcio si è osservato che la massima produzione di paclitaxel e baccatina è stata riscontrata nel bioreattore STIRRED. Infatti come possiamo notare nel grafico, nel bioreattore STIRRED la produzione di paclitaxel era 5 volte maggiore rispetto alle cellule libere nel mezzo di coltura e anche quella di baccatina era 1.6 volte maggiore. Colture vegetali in vitro come sistema biotecnologico per la produzione di composti bioattivi

BIOREATTORE AIRLIFT SPECIE DI INTERESSE COLTURE DI Taxus baccata Contenuto di Paclitaxel in cellule immobilizzate: 12,03 mg/L a 24 giorni cellule in sospensione: 6,94 mg/L a 24 giorni Per quanto riguarda il bioreattore AIRLIFT, il contenuto di paclitaxel, nelle cellule immobilizzate era quasi due volte più alto che nelle sospensioni cellulari libere. Questo è stato un vero e proprio passo in avanti, in quanto, si è potuto constatare l’importanza dei bioreattori per la produzione di paclitaxel a livello industriale. Colture vegetali in vitro come sistema biotecnologico per la produzione di composti bioattivi

COLTURE ETEROTROFICHE ALGALI SPECIE DI INTERESSE COLTURE ETEROTROFICHE ALGALI VANTAGGI SVANTAGGI Bassa diffusione di luce Contaminazioni aeree Condizioni meteorologiche locali Coltivazioni più economiche Maggiore biomassa algale Sfruttamento di terreni di basso valore Le tecniche di coltura in vitro, possono anche essere applicate alle colture di microalghe. Poiché tutte le microalghe sono fotosintetiche (e molte sono efficienti convertitori dell’energia solare) vengono coltivate in ambienti illuminati naturalmente o artificialmente affinché si ottenga una cospicua crescita e una densa popolazione. Pertanto l’opzione più comune nei sistemi industriali è uno stagno aperto che imiti l’ambiente naturale delle microalghe. La vasca più comune è la vasca raceway di forma ovale, simile ad un circuito automobilistico. Questi sistemi di coltivazione presentano costi di costruzione relativamente bassi e grandi impianti potrebbero essere allestiti in aree non destinate all’agricoltura. Tuttavia queste vasche aperte presentano anche diversi svantaggi come la diffusione della luce, risulta essere relativamente scarsa, in quanto diminuisce con la profondità che però è essenziale per il corretto funzionamento di questi sistemi, oppure mantenere una monocoltura di microalghe desiderate è difficile da mantenere a causa della costante contaminazione aerea; e poi c’è da tener conto delle condizioni meteorologiche locali, che non possono essere controllate e cambiano con le stagioni. Vasca raceway Colture vegetali in vitro come sistema biotecnologico per la produzione di composti bioattivi

COLTURE ETEROTROFICHE ALGALI SPECIE DI INTERESSE COLTURE ETEROTROFICHE ALGALI REGIME DI CRESCITA MIXOTROFICO AGGIUNTA DI CARBONIO ACETATO AUMENTO DI BIOMASSA per superare tali svantaggi, viene sfruttata la capacità delle microalghe di crescita eterotrofica, in assenza di luce in cui la fonte di carbonio organico viene disciolta nel mezzo di coltura. Tale regime di crescita viene chiamato mixotrofico ed è una variante di quello eterotrofico, dove l’anidride carbonica ed il carbonio organico sono contemporaneamente assimilati ed operano entrambi i metabolismi respiratorio e fotosintetico. Nelle colture a vasca aperta il carbonio viene aggiunto, sotto forma di acetato e glucosio, in piccole quantità. Questo viene fatto per poter sostenere una biomassa microalgale maggiore e impedire l’eccessiva crescita batterica. GLUCOSIO Colture vegetali in vitro come sistema biotecnologico per la produzione di composti bioattivi

COLTURE ETEROTROFICHE ALGALI: ACCUMULO DI LIPIDI SPECIE DI INTERESSE COLTURE ETEROTROFICHE ALGALI: ACCUMULO DI LIPIDI FATTORI: Temperatura pH Squilibri nutrizionali Regime di crescita Età della coltura Ceppo specifico Crypthecodinium cohnii Prima Fase: divisione cellulare esponenziale  diminuzione di sostanze nutritive Seconda Fase: blocco crescita  trasformazione di zuccheri in lipidi Un’importante applicazione delle colture di microalghe è il loro sfruttamento per interventi ambientali, come il trattamento delle acque reflue, la fertilizzazione dei suoli, la produzione di biocarburanti e la fitodepurazione dei rifiuti tossici. Diverse specie di microalghe possono essere indotte ad una sovrapproduzione specifica di acidi grassi, mediante semplici manipolazioni delle proprietà chimico-fisiche del terreno di coltura. L’accumulo di lipidi nelle cellule delle microalghe dipende da diversi fattori: temperatura di crescita, pH, squilibri nutrizionali di carbonio, azoto, fosforo, e silicio, regime di crescita, età della coltura ed il ceppo microalgale specifico. Nell’alga marina CRYPTHECODINIUM COHNII l’accumulo di glucosio è superiore rispetto al fabbisogno dunque l’eccesso viene accumulato sotto forma di lipidi. Tale processo viene realizzato in due fasi: nella prima fase, la divisione cellulare esponenziale porta alla diminuzione di alcune sostanze nutritive limitanti per la crescita, e una seconda fase in cui le cellule arrestano la crescita e trasformano gli zuccheri accumulati in lipidi. Colture vegetali in vitro come sistema biotecnologico per la produzione di composti bioattivi

COLTURE ETEROTROFICHE ALGALI: PRODUZIONE DI BIODIESEL SPECIE DI INTERESSE COLTURE ETEROTROFICHE ALGALI: PRODUZIONE DI BIODIESEL In Chlorella protothecoides: Un’opzione attraente per la biotecnologia applicata alle microalghe è l’ottenimento di biocarburanti. Attualmente la produzione di biodiesel dipende dagli oli vegetali, come quelli ottenuti da soia, girasole e palma, contenenti acidi grassi a catena lunga. Ciò implica una disponibilità stagionale e un grande impiego di terreni agricoli a scapito delle colture alimentari. Proprio per questo il biodiesel di origine algale è un’alternativa attraente e realizzabile, soprattutto perché alcuni ceppi algali possono essere geneticamente modificati per produrre gli acidi grassi desiderati, minimizzando le ripercussioni sull’ambiente. Inoltre la loro produttività supera quella delle colture oleaginose ed è economicamente conveniente e non soggetta a cambiamenti stagionali, quindi il prodotto può essere raccolto giornalmente durante tutto l’arco dell’anno. In particolare la microalga Chlorella prothecoides è adatta per la produzione di biodiesel in quanto è in grado di produrre una quantità di lipidi che raggiunge il 50 % del peso secco. quantità di lipidi pari al 50% del peso secco Colture vegetali in vitro come sistema biotecnologico per la produzione di composti bioattivi

CONCLUSIONI: Le colture in vitro : Ottima alternativa all’estrazione diretta costi più bassi della sintesi chimica In conclusione le tecniche di coltura in vitro si dimostrano un’ottima alternativa rispetto all’estrazione diretta in natura e certamente molto più economica rispetto alla sintesi totale dei composti. Tuttavia i protocolli sperimentali, per la maggior parte delle sostanze, sono ancora in fase di ottimizzazione e solo il tempo potrà indicare l’approccio migliore per rendere competitive le biotecnologie cellulari vegetali per la produzione industriale di prodotti naturali. ancora in fase di sperimentazione… Colture vegetali in vitro come sistema biotecnologico per la produzione di composti bioattivi