Separazione cromatografica enantioselettiva

Una specie chimica chirale esiste come due forme isomeriche che sono l’una l’immagine speculare dell’altra e non sono tra loro sovrapponibili (enantiomeri) Per i composti farmaceutici, la chiralità è dovuta, nella maggior parte dei casi, alla presenza di un atomo tetracoordinato al quale sono legati quattro atomi o gruppi di atomi diversi. La difficoltà nella separazione/analisi di enantiomeri è dovuta la fatto che gli isomeri hanno proprietà chimiche e fisiche identiche (es. punto fusione, ebollizione, proprietà spettroscopiche, etc) Per distinguere gli enanatiomeri è necessaria una interazione con un’entità anch’essa chirale con formazione di diasteroisomeri

Ove E1 e E2 rappresentano l’ammontare dei due enantiomeri La tecnica HPLC rappresenta la metodologia più utilizzata per la determinazione dell’eccesso enantiomerico %e.e. = (E1-E2)/(E1+E2) X100 Ove E1 e E2 rappresentano l’ammontare dei due enantiomeri I metodi HPLC impiegati per la determinazione della composizione enantiomerica sono classificati in metodi diretti e indiretti ADC= agente derivatizzante chirale; SC selettore chirale legato alla matrice silicea

METODO INDIRETTO il metodo indiretto è basato sulla reazione della miscela di enantiomeri con un reagente a stereochimica definita per formare una coppia di diasterosiomeri (reazione di derivatizzazione chirale) I diasterosiomeri sono quindi separati con fasi stazionarie non chirali La derivatizzazione può anche inserire opportuni cromofori/fluorofori per aumentare la risposta al detector Metodo usato per determinare enantiomeri in matrici complesse

Requisiti per metodo indiretto Derivatizzante: dovrebbe esistere come unico enantiomero o avere eccesso enantiomerico altissimo Reazione di derivatizzazione deve andare a completezza Disateroisomeri devono fornire stessa risposta al rivelatore

Metodo diretto Attualmente è il più utilizzato data l’ampia disponibilità commerciale di fasi stazionarie chirali Si basa su selettori chirali legati alla fase stazionaria che formano addotti diasterosiomerici non covalenti. La diversa stabilità degli addotti diasteroisomerici si traduce in un diverso tempo di ritenzione in colonna per i due enantiomeri Da un punto di vista teorico, la discriminazione chirale richiede almeno tre interazioni simultanee tra il selettore e l’enantiomero e uno di queste interazioni deve dipendere dalla stereochimica dell’analita

La discriminazione chirale può anche avvenire per aggiunta del selettore chirale alla fase mobile e in questo modo si possono utilizzare fasi stazionarie non chirali Tra gli inconvenienti: costi alti e la possibile interferenza del selettore con il detector.

Classi di fasi stazionari chirali Le fasi stazionarie chirali posso essere classificate sulla base del meccanismo di discriminazione chirale coinvolto: 1. A scambio di legante 2. Interazione multipla, fasi tipo «Pirkle» (selettore chirale: composto organico a basso PM) 3. Interazione multipla (selettore chirale: antibiotici macrociclici) 4. Complessi di inclusione (selettore: ciclodestrine) 5. Interazioni attrattive ed inclusione (selettore: polimero sintetico o naturale) 6. Interazioni idrofobiche e polari (selettore: proteine)

1. Cromatografia a scambio di legante Utilizzato per la separazione di molecole bidentate capaci di formare complessi con ioni di metalli di transizione. Molto usata per analisi di amminoacidi Selettore chirale maggiormente usato è la (S-)prolina, immobilizzata su fase stazionaria e Cu2+ in fase mobile La risoluzione enantiomerica si basa sulla diversa stabilità dei complessi disteroisomerici L-Cu-L + (S)-L’ L-Cu-(S)-L’ + L L-Cu-L + (R)-L’ L-Cu-(R)-L’ + L

2. Interazione multipla: fasi di tipo «Pirkle» Utilizzate sia a livello analitico sia preparativo Selettore chirale: molecole semplici con uno o al massimo due centri stereogenici caratterizzate dalle seguenti funzioni: Gruppo aromatico Possibilità formare ponti idrogeno Possibilità formare interazioni dipolo/dipolo Presenza gruppi ingombranti per il controllo conformazionale dell’interazione

3. Interazione multipla: fasi con antiobiotici macrociclici Gli antibiotici macrociclici sono utilizzati quali selettori chirali data la loro complessità strutturale con numerosi centri stereogenici e gruppi funzionali che offrono varie modalità di interazioni con analiti enantiosielettivi vancomicina

4. Complessi di inclusione Separazione basata sulla inclusione enantiosilettiva in cavità chirali del selettore. Tra i selettori più comuni le ciclodestrine (polimeri del d-glucosio) con diametro della cavità in dipendenza del numero di residui monosaccaridici da 5.7 A a 9.5 A)

I gruppi OH sono rivolti all’esterno e quindi la cavità assume una natura tendenzialmente idrofobica permettendo l’inclusione di composti non polari. Per una buona separazione è utile la presenza di un anello aromatico vicino al centro stereogenico: l’anello aromatico viene incluso nella cavità mentre il resto della molecola (polare) interagisce con i grippi OH esterni Molto usate le ciclodestrine come additivi chirali nella fase mobile per analisi enantioselettive su fasi stazionarie non chirali

5. Interazioni attrattive ed inclusione (selettori: polimeri sintetici e naturali) Selettori polimerici (es derivati cellulosa, amilosio) sono ad elevata enantioselettività nei confronti di svariate classi di farmaci Il meccanismo di separazione si basa sull’inclusione dell’analita nella cavità chirale formatasi per conformazione ordinata del polimero

6. Interazioni idrofobiche e polari (selettore proteine) Le proteine più utilizzate sono le proteine di trasporto nel siero quali l’alfa-glicoproteina e la sieroalbumina. Il meccanismo di discriminazione chirale si base sia su interazioni sia idrofobiche sia polari (le interazioni idrofobiche sono necessarie all’interazione con la fase stazionaria quelle idrofile per l’enantioselttività)

Silica gel BC for chiral chromatography. 1161300. 01/2008:2217 corrected 7.3 Lamivudine Lamivudinum C8H11N3O3S Mr 229.3 [134678-17-4] DEFINITION 4-Amino-1-[(2R,5S)-2-(hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5-yl]pyrimidin-2(1H)-one. Content: 97.5 per cent to 102.0 per cent (dried substance). Enantiomeric purity. Liquid chromatography (2.2.29): use the normalisation procedure. Test solution. Dissolve 25.0 mg of the substance to be examined in water R and dilute to 100.0 mL with the same solvent. Reference solution. Dissolve the contents of a vial of lamivudine for system suitability 2 CRS (containing impurity D) in 1.0 mL of water R. Column: —  size: l = 0.25 m, Ø = 4.6 mm; —  stationary phase: silica gel BC for chiral chromatography R ►(5 µm)◄; —  temperature: maintain at constant temperature between 15 °C and 30 °C; the temperature may be adjusted to optimise the resolution between lamivudine and impurity D; a lower temperature favours improved resolution. Silica gel BC for chiral chromatography. 1161300. A very finely divided silica gel for chromatography (5 µm) coated with β-cyclodextrin. Higher selectivity may be obtained when cyclodextrin has been derivatized with propylene oxide.

Mobile phase: mix 5 volumes of methanol R and 95 volumes of a 7 Mobile phase: mix 5 volumes of methanol R and 95 volumes of a 7.7 g/L solution of ammonium acetate R. Flow rate: 1.0 mL/min. Detection: spectrophotometer at 270 nm. Injection: 10 µL. Run time: twice the retention time of lamivudine. Relative retention with reference to lamivudine (retention time = about 8 min): impurity D = about 1.2; impurity B and enantiomer = about 1.3 and 1.5. System suitability: reference solution: —  peak-to-valley-ratio: minimum 15, where Hp = height above the baseline of the peak due to impurity D and Hv = height above the baseline of the lowest point of the curve separating this peak from the peak due to lamivudine. Calculate the sum of the percentage contents of all impurity peaks with a relative retention from 1.2 to 1.5. Subtract the percentage content of impurity B as obtained in the test for related substances. Limit: —  impurity D: maximum 0.3 per cent.