Identificazione mediante analisi dei lipidi della parete

gli acidi micolici acidi grassi, ramificati in posizione β presenti nella parete batterica dei generi: Corynebacterium: 22-38 atomi di C Rhodococcus: 34-52 atomi di C Nocardia: 44-60 atomi di C Gordonia: 48-66 atomi di C Tsukamurella: 64-78 atomi di C Mycobacterium: 60-90 atomi di C presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici alfa-, alfa'-, metoxi-, keto-, epoxi-, wax ester-, omega' metoxi-mycolati

la parete dei micobatteri altri lipidi complessi acidi micolici arabino-galattano peptidoglicano membrana cellulare

struttura degli acidi micolici Catena alchilica principale (38-58C) Ramificazione alchilica (21-23C) CHOH CH2 CH-COOH

cromatografia su strato sottile separazione dei vari ac. micolici su piastre di gel di silice e successivo evidenziamento mediante opportune colorazioni identificazione delle “macchie” in base alla loro posizione rispetto al fronte di avanzamento della fase mobile identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi micolici

cromatografia su strato sottile

gas-cromatografia pirolisi degli acidi micolici in esteri metilici saturi di 22, 24 e 26 atomi di C separazione dei prodotti di clivaggio nonché degli acidi grassi saturi ed insaturi (fra i quali l’acido tubercolostearico) e degli alcol identificazione delle catene di C preferibilmente usando la spettrometria di massa identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi grassi

gas-cromatografia

il principio della HPLC la fase mobile è spinta ad elevata pressione attraverso la fase stazionaria (particelle paccate) contenuta nella colonna il campione viene iniettato direttamente all'interno del flusso della fase mobile la separazione delle varie frazioni del campione è determinata dalla diversa polarità delle due fasi le frazioni eluite vengono quantizzate in base alla loro assorbanza

le componenti del sistema iniettore pompe colonna solventi detector cromatogramma recorder

preparazione del campione saponificazione una ansata di colonie in potassa alcolica per 1h a 121°C estrazione aggiunta di cloroformio dopo acidificazione evaporazione dello strato non acquoso aggiunta di bicarbonato e ulteriore evaporazione solubilizzazione del residuo secco in cloroformio derivatizzazione esterificazione con bromofenacil bromuro, in presenza di catalizzatore, per 40 min a 80°C evaporazione e aggiunta al residuo secco di cloroformio, ac. cloridrico e metanolo recupero ed evaporazione dello strato di cloroformio

identificazione dei picchi 1 TRR=5,3/9,6 SI 5,3 9,6

identificazione dei picchi 2 SI1 SI2

esempi di profili HPLC M. tuberculosis M. simiae

le fasi del processo di identificazione mediante HPLC confronto visivo del profilo comatografico in esame con quelli di specie note identificando, quando necessario, i picchi in base ai tempi di ritenzione relativi il riconoscimento, per confronto con i tracciati cromatografici presenti in memoria, è operato da un apposito software

i vantaggi dell'impiego della HPLC rapido (poche ore) single-step specie-specifico economico utilizzabile per: diagnostica clinica (identificazione isolati) ricerca (riconoscimento di nuove specie)

i limiti della HPLC specie con profili simili (MAC e M. scrofulaceum, nuovi micobatteri a crescita rapida) apparecchiatura costosa non utilizzabile direttamente sui materiali clinici