Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati Francesco De Sio Stazione Sperimentale per l’Industria delle Conserve Alimentari Via Nazionale 121/123 – 84012 Angri (SA) tel. 081 5133742 fax 081 5133721 E-mail: francesco.desio@ssica.it

CAROTENOIDI POLIFENOLI PROPRIETA’ ANTITUMORALI Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CAROTENOIDI PROPRIETA’ ANTITUMORALI (Peto e altri, 1981; Stahl e Sies, 1996) PROPRIETA’ ANTIOSSIDANTI (Di Mascio e al.,1989; Conn e al., 1991; Levy e al., 1995) POLIFENOLI PROPRIETA’ ANTITUMORALI (Wattenburg, 1985) PROPRIETA’ ANTIOSSIDANTI (Shahidi e Naczk, 1995) LIMITAZIONE MALATTIE CARDIOVASCOLARI (Hertog e al., 1993)

ANALISI DEI CAROTENOIDI Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ANALISI DEI CAROTENOIDI

CAROTENI: idrocarburi insaturi catena idrocarburica C22 Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati STRUTTURA CAROTENI: idrocarburi insaturi CAROTENOIDI (C40H56) XANTOFILLE: derivati ossigenati catena idrocarburica C22

Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ESTRAENTE tetraidrofurano (THF) etere di petrolio metanolo acetone da soli o miscelati, con o senza preventiva precipitazione della polpa IN LETTERATURA: DICLOROMETANO/METANOLO 2/1 v/v con idrossitoluene butilato (BHT) 0,1% come antiossidante

ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DEL CAMPIONE Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DEL CAMPIONE PESARE, IN IMBUTO SEPARATORE DA 250 ml, IL CAMPIONE PERFETTAMENTE OMOGENEIZZATO (EVENTUALMENTE CENTRIFUGARE PER ALLONTANARE L’ACQUA), IN QUANTITA’ TALE CHE LA CONCENTRAZIONE FINALE DI UN PIGMENTO NON SUPERI 10 mg/Kg AGGIUNGERE 30 ml DI MISCELA ESTRAENTE, AGITARE PER QUALCHE MINUTO E LASCIARE A RIPOSO FINO A COMPLETA SEPARAZIONE DELLE 2 FASI RACCOGLIERE LO STRATO INFERIORE COLORATO IN PALLONE E SUL RIMANENTE RIPETERE L’ESTRAZIONE, FINO A SBIANCARE COMPLETAMENTE LA POLPA TIRARE A SECCO L’ESTRATTO SOTTO VUOTO, SENZA SUPERARE I 40 °C RIPRENDERE CON ALMENO 3 ml DI CLOROFORMIO CON LO 0,1% DI BHT, FILTRARE CON 0,45 mm IN CELLULOSA RIGENERATA E INIETTARE IN CROMATOGRAFO

CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE 1 Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE 1 Colonna C18 Synergi, 4 mm, Hydro-RP 80Å, 250 x 4,6 mm (Phenomenex®), termostatata a 35 °C; Volume d’iniezione 10 ml; Rivelatore spettrofotometrico a 450 nm; Eluente: miscela di metanolo / tetraidrofurano / acqua, nelle percentuali rispettivamente di 57 / 37 / 6, v/v/v; Velocità di flusso 1,20 ml/minuto.

CROMATOGRAMMA 1 DEGLI STANDARD Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CROMATOGRAMMA 1 DEGLI STANDARD Licopene e b-carotene puri, ciascuno 10 mg/Kg

ANALISI DI POMODORO FRESCO Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ANALISI DI POMODORO FRESCO Le quantità sono espresse in mg/Kg: licopene 102,6; b-carotene 3,7.

Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CONCLUSIONI 1 Il metodo presentato evidenzia la rapidità e l’efficacia della miscela estraente diclorometano/metanolo: in genere sono sufficienti 2 cicli per estrarre più del 98% dei pigmenti, con risparmio sul costo dei materiali e del tempo di analisi. Le condizioni cromatografiche presentate sono da ritenersi di elezione per matrici prive di clorofille perché, ove presenti, possono interferire nel cromatogramma. Per rimuoverle, prima dell’iniezione in colonna è necessaria un’idrolisi basica del campione. La coppia eluente/colonna impiegata permette di ottenere un cromatogramma di sufficiente efficienza e selettività per il licopene e il b-carotene. I tempi e i costi di analisi sono sensibilmente ridotti rispetto ad altri metodi.

CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE 2 Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE 2 Colonna C30, 5 mm, 250 x 4,6 mm (Chemtek), termostatata a 30 °C; Volume d’iniezione 10 ml; Rivelatore spettrofotometrico a 450 nm; Gradiente binario lineare: A = CH3OH / H2O 95/5 v/v allo 0,1% in BHT e 0,05% in trietilammina (TEA) B = CH2Cl2 allo 0,1% in BHT e 0,05% in TEA tempo (min) flusso (ml/min) A (%) B 0,00 1,00 95,0 5,00 35,0 30,0 70,0 40,0 seguito da 10’ di riequilibrio al 95% di A prima della successiva iniezione

CROMATOGRAMMA 2 DEGLI STANDARD Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CROMATOGRAMMA 2 DEGLI STANDARD 1: luteina, 2: zeaxantina, 3: trans-b-apo-8’-carotenale, 4: b-criptoxantina, 5: clorofilla b, 6: a-carotene, 7: clorofilla a, 8: b-carotene, 9: licopene. La concentrazione della clorofilla a è 50 mg/Kg; per tutti gli altri è 15 mg/Kg.

ANALISI DI OLIO ESSENZIALE DI MANDARINO VERDE Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ANALISI DI OLIO ESSENZIALE DI MANDARINO VERDE L’olio essenziale è stato iniettato senza nessun trattamento. Le quantità, in parentesi, sono espresse in mg/Kg. 1: luteina (10,4), 2: zeaxantina (1,6), 3: b-criptoxantina (4,4), 4: clorofilla b (1,4), 5: a-carotene (6,6), 6: clorofilla a (92,2), 7: b-carotene (10,4).

ANALISI DI ZUCCA FRESCA Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ANALISI DI ZUCCA FRESCA

Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ATTIVITA’ PROVITAMINICA A (RETINOLO) DEI CAROTENOIDI (etichettatura di alimenti conservati) Retinolo (vitamina A) b-carotene (attivo 100%) 1U.I. di vitamina A = 0,0006 mg b-carotene a-carotene (attivo 50%) 1U.I. di vitamina A = 0,0012 mg a-carotene g-carotene (attivo 50%) 1U.I. di vitamina A = 0,0012 mg g-carotene b-criptoxantina (attiva 50%) 1U.I. di vitamina A = 0,0012 mg b-criptoxantina

ANALISI DI PEPERONCINO ROSSO Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ANALISI DI PEPERONCINO ROSSO Le quantità sono espresse in mg/Kg: b-criptoxantina 4,5; a-carotene 11,8; b-carotene 23,6.

ANALISI DI SUGO PRONTO ALLA BOLOGNESE Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ANALISI DI SUGO PRONTO ALLA BOLOGNESE Le quantità sono espresse in mg/Kg: b-criptoxantina 0,2; a-carotene 0,8; b-carotene 4,3.

Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CONCLUSIONI 2 Il metodo presentato evidenzia la rapidità e l’efficacia della miscela estraente diclorometano/metanolo: in genere sono sufficienti 2 cicli per estrarre più del 98% dei pigmenti, con risparmio sul costo dei materiali e del tempo di analisi. Il campione in esame non necessita di idrolisi perché le clorofille, ove presenti, non interferiscono nel cromatogramma. La coppia eluenti/colonna impiegata permette di ottenere un cromatogramma di buona efficienza e discreta selettività per un elevato numero di molecole. Il metodo presentato è molto versatile e ben si presta a differenti impieghi analitici.

ANALISI DEI FLAVONOIDI Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ANALISI DEI FLAVONOIDI

Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati STRUTTURA NARINGENINA NARINGINA STRUTTURA DEL TIPO C6-C3-C6, COSTITUITA DA DUE ANELLI AROMATICI UNITI DA TRE ATOMI DI CARBONIO CHE, SOLITAMENTE, FORMANO CON UN ATOMO DI OSSIGENO UN ETEROCICLO. SONO PRESENTI IN NATURA SIA LE FORME GLUCOSIDICHE CHE I CORRISPONDENTI AGLICONI.

(*) METODO EUROPEO NORMATO N° EN 12148:1996 E Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ESTRAENTE Metanolo Etanolo N,N-dimetilformammide Acqua da soli miscelati temperatura ambiente riscaldando fino a 90°C (*) IN LETTERATURA: DIMETILSOLFOSSIDO/ETANOLO 1/19 v/v (in questa successione) con tert-butilidrochinone (TBHQ) 0,2% come antiossidante (*) METODO EUROPEO NORMATO N° EN 12148:1996 E

CONFRONTO TRA METODI SU SUCCO D’ARANCIA DEL COMMERCIO Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CONFRONTO TRA METODI SU SUCCO D’ARANCIA DEL COMMERCIO Metodo normato, valore medio di 5 analisi mg/Kg Metodo proposto, accreditato SINAL, Eriocitrina 1,15 1,11 Neoeriocitrina 1,13 1,01 Narirutina 18,12 18,03 Esperidina 151,40 151,39 Didimina 10,12 10,31

ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DEL CAMPIONE NON IDROLIZZATO Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DEL CAMPIONE NON IDROLIZZATO IN MATRACCIO DA 100 ml SI PESANO 10 g DI CAMPIONE PERFETTAMENTE OMOGENEIZZATO SI AGGIUNGONO 2,5 ml DI DIMETILSOLFOSSIDO E POI 47,5 ml DI ETANOLO CON 0,4% DI TBHQ PREPARATO AL MOMENTO SI PORTA A VOLUME CON ACQUA E SI AGITA PER CIRCA 15’ FILTRARE CON 0,45 mm E INIETTARE IN CROMATOGRAFO

ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DEL CAMPIONE IDROLIZZATO Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DEL CAMPIONE IDROLIZZATO IN PALLONE DA 250 ml PESARE 10 g DI CAMPIONE PERFETTAMENTE OMOGENEIZZATO AGGIUNGERE 50 ml DI ETANOLO CON 0,4% DI TBHQ (da preparare al momento) E 20 ml DI ACQUA 8 ml ACIDO CLORIDRICO 37% RISCALDARE A LEGGERA EBOLLIZIONE PER 2,5 ORE RAFFREDDARE E PORTARE A 100 ml FILTRARE CON 0,45 mm E INIETTARE IN CROMATOGRAFO

CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE Colonna Luna, 3 mm, C18(2), 150 x 4,6 mm (Phenomenex®), termostatata a 35 °C; Volume d’iniezione 20 ml; Rivelatore spettrofotometrico: a 226 nm per rutina, luteolina, naringenina, apigenina; a 284 nm per eriocitrina, neoeriocitrina, narirutina,naringina, esperidina, neoesperidina, didimina; a 369 nm per quercetina, kaempferolo, isoramnetina;

Gradiente binario lineare: Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati Gradiente binario lineare: eluente A = 20 ml di KH2PO4 0,25 M sono portati a 1 litro con acqua e tamponati a pH 3,10 con H3PO4 diluito; eluente B = 130 ml di acqua, 20 ml di KH2PO4 0,25 M, 100 µl di H3PO4 85% e 350 ml di acetonitrile, nell’ordine; tempo (min) flusso (ml/min) A (%) B 0,0 1,20 100,0 0,00 5,0 75,0 25,0 30,0 58,0 42,0 34,0 34,1 39,0 seguito da 10’ di riequilibrio al 100% di A prima della successiva iniezione

Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CROMATOGRAMMA DEGLI STANDARD Miscele di standard 10 mg/Kg ciascuno, alle tre lunghezze d'onda selezionate 226 nm: 1.rutina, 2.luteolina, 3.naringenina, 4.apigenina; 284 nm: 1.eriocitrina, 2.neoeriocitrina, 3.narirutina, 4.naringina, 5.esperidina, 6.neoesperidina, 7.didimina; 369 nm: 1.quercetina, 2.kaempferolo, 3.isoramnetina.

Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati Analisi di succo d’arancia del commercio. Particolare del cromatogramma ottenuto a 284 nm. Concentrazione in mg/Kg: eriocitrina 1,1; neoeriocitrina 1,0; narirutina 18,0; esperidina 151,4; didimina 10,3.

Analisi di succhi di ananas del commercio Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati Analisi di succhi di ananas del commercio in marrone campione tal quale in rosso campione con aggiunta di succo d’arancia

Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CONCLUSIONI Sono state valutate le diverse metodiche di preparazione del campione ed analisi presenti in letteratura. E’ stata illustrata una metodica alternativa che presenta i seguenti vantaggi: minore tossicità dell’estraente; possibilità di effettuare l’estrazione a temperatura ambiente; risultati qualitativi e quantitativi confrontabili con quelli ottenuti con metodi normati.

ANALISI DEI POLIFENOLI Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ANALISI DEI POLIFENOLI

Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati STRUTTURA

ESTRAENTE IN LETTERATURA: spesso filtrazione del campione acquoso Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ESTRAENTE IN LETTERATURA: spesso filtrazione del campione acquoso CAMPIONE : ETANOLO 1 : 1 IN AMBIENTE SOLO ACQUOSO ALCUNI POLIFENOLI VENGONO ESTRATTI POCO O AFFATTO Particolare del cromatogramma a 220 nm di nettare di mela Annurca: in marrone campione tal quale filtrato in rosso campione estratto in alcol etilico e filtrato

ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DEL CAMPIONE Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DEL CAMPIONE PESARE, IN MATRACCIO DA 50 ml, 20 g DI CAMPIONE AGGIUNGERE 20 g DI ETANOLO AGITARE PER CIRCA 10’ FILTRARE CON 0,45 mm E INIETTARE IN CROMATOGRAFO

CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE Colonna Luna, 3 mm, C18(2), 150 x 4,6 mm (Phenomenex®), termostatata a 30 °C; Volume d’iniezione 20 ml; Rivelatore spettrofotometrico: a 220 nm per ac. p-amminobenzoico, ac. gallico, ac. protocatecuico, tirosina, catechina, epicatechina; a 280 nm per florizina e ac. cinnammico; a 320 nm per ac. clorogenico, ac. caffeico, ac. cumarico, ac. ferulico;

Gradiente binario lineare: Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati Gradiente binario lineare: eluente A = acido trifluoroacetico 0,75% v/v; eluente B = acetonitrile; tempo (min) flusso (ml/min) A (%) B 0,0 1,00 98,0 2,0 5,0 25,0 85,0 15,0 47,5 60 40,0 47,6 100,0 52,0 seguito da 10’ di riequilibrio al 98% di A prima della successiva iniezione

CROMATOGRAMMA DEGLI STANDARD Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CROMATOGRAMMA DEGLI STANDARD Tra parentesi le concentrazioni in mg/Kg: 220 nm 1.ac. p-amminobenzoico (11,2); 2.ac. gallico (0,8); 3.ac. protocatecuico (14,7); 4.tirosina (200); 5.catechina (9,6); 6.epicatechina (12,7); 280 nm 1.florizina (8,9); 2.ac. cinnammico (12,7) 320 nm 1.ac. clorogenico (50); 2.ac. caffeico (10,6); 3.ac. cumarico (8); 4.ac. ferulico (5,7).

Analisi di nettare di mela Annurca Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati Analisi di nettare di mela Annurca 220 nm 280 nm 320 nm Concentrazioni in mg/Kg: catechina 13,2; epicatechina 38,6; florizina 3,8; ac. clorogenico 113,7; ac. caffeico 2,0; ac. cumarico 0,4; ac. ferulico 0,4.

Analisi di patata liofilizzata Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati Analisi di patata liofilizzata 220 nm 280 nm 320 nm Concentrazioni in mg/Kg: ac. gallico 3,5; tirosina 721; epicatechina 4,2; florizina 6,3; ac. cinnammico 0,7; ac. clorogenico 150; ac. caffeico 12,0; ac. cumarico 1,2; ac. ferulico 1,5.

Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CONCLUSIONI Sono state valutate le diverse metodiche di preparazione del campione ed analisi presenti in letteratura. E’ stata illustrata una metodica alternativa che presenta il vantaggio, impiegando etanolo come estraente, di ottenere una completa solubilizzazione delle molecole polifenoliche senza incrementare il tempo di preparazione del campione.

ANALISI DEL RESVERATROLO (nel vino) Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ANALISI DEL RESVERATROLO (nel vino)

ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DEL CAMPIONE Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DEL CAMPIONE 20 ml DI CAMPIONE E 20 ml DI ESTRAENTE (DICLOROMETANO/ETILE ACETATO 50%) IN IMBUTO SEPARATORE. RACCOGLIERE LA FASE INFERIORE TRASPARENTE E RIPETERE L’ESTRAZIONE. FILTRARE L’ESTRATTO SU SODIO SOLFATO ANIDRO TIRARE A SECCO SENZA SUPERARE I 40 °C RIPRENDERE L’ESSICATO CON 2 ml DI ETILE ACETATO FILTRARE CON 0,45 mm E INIETTARE IN CROMATOGRAFO

CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CONDIZIONI CROMATOGRAFICHE Colonna Luna, 3 mm, C18(2), 150 x 4,6 mm (Phenomenex®), termostatata a 30 °C; Volume d’iniezione 20 ml; Rivelatore spettrofotometrico a 310 nm; Gradiente binario lineare: eluente A = acido trifluoroacetico 0,75% v/v; eluente B = acetonitrile; tempo (min) flusso (ml/min) A (%) B 0,0 1,00 95,0 5,0 20,0 80,0 seguito da 5’ al 100% di B per lavaggio colonna e 10’ di riequilibrio al 95% di A prima della successiva iniezione

CROMATOGRAMMA DELLO STANDARD Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CROMATOGRAMMA DELLO STANDARD

ANALISI DI VINO ROSSO Particolare del cromatogramma di vino rosso: Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati ANALISI DI VINO ROSSO Particolare del cromatogramma di vino rosso: in rosso campione estratto e concentrato 10 volte in nero campione iniettato tal quale

Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati CONCLUSIONI E’ stata illustrata una metodica che, impiegando la miscela diclorometano/etile acetato 50% come estraente, permette di ottenere la solubilizzazione del trans-resveratrolo presente nel campione e un cromatogramma sufficientemente selettivo rispetto alla molecola di interesse analitico.

Analisi HPLC di carotenoidi e di polifenoli in prodotti ortofrutticoli freschi e derivati BIBLIOGRAFIA CAROTENOIDI D. J. Hart e K. J. Scott, Development and evaluation of an HPLC method for analysis of carotenoids in foods, and the measurement of the carotenoid content of vegetables and fruits commonly consumed in the UK, Food Chemistry, 54, 101-104 (1995) R. Rouseff e L. Raley, Application of diode array detection with a C-30 reversed phase column for the separation and identification of saponified orange juice carotenoids, J. Agric. Food Chem., 44, 2176-2181 (1996) F. De Sio, B. Laratta, A. Giovane, L. Quagliuolo, D. Castaldo, L. Servillo, Analysis of free and esterified ergosterol in tomato products, J. Agric. Food Chem., 48, 780-784 (2000) F. De Sio, M. Grimaldi, R. Loiudice, Introduzione all’HPLC e Metodi Analitici per Alimenti Vegetali, Morgan Edizioni Tecniche, Milano (1999) F. De Sio, L. Servillo, R. Loiudice, B. Laratta, D. Castaldo, A chromatographic procedure for the determination of carotenoids and chlorophylls in vegetable products, Acta Alimentaria, 30 (4), 395-405 (2000) FLAVONOIDI M. G. L. Hertog, P. C. H. Hollman, D. P. Venema, Optimization of a quantitative HPLC determination of potentially anticarcinogenic flavonoids in vegetables and fruits, J. Agric. Food Chem., 40, 1591-1598 (1992) R. Grandi, A. Trifirò, S. Gherardi, M. Calza, G. Saccani, Characterization of lemon juice on the basis of flavonoid content, Fruit Process., 11, 355 (1994) M. Rapacciuolo, F. De Sio, Analisi cromatografica di flavonoidi in vegetali e loro derivati, Industria Conserve, 78, 281-292 (2003) POLIFENOLI S. Kermasha, M. Goetghebeur, J. Dumont, R. Couture, Analyses of phenolic and furfural compounds in concentrated and non-concentrated apple juices, Food Research. Int., 28, 245-252 (1995)