Molecular simulation of proteins involved in neurodegenerative diseases:  the case of alpha-synuclein Valeria Losasso German Research School for Simulation Sciences GmbH Jülich, Germany

Parkinson’s disease (PD) Fatal neurodegenerative movement disorder, affecting an estimated four million people worldwide Loss of the neuromelanine expressing dopamine (DOP) neurons in the substantia nigra pars compacta Diagnostic features: Tremor Rigidity Akinesia and bradykinesia Postural instability Polymeropoulos MK et al., Science, (1997)

Parkinson’s disease (PD) Deposition of Lewy bodies Spillantini MG et al., Nature, 1997 Major components: aggregates of alpha-synuclein (a-syn) protein N-terminal NAC C-terminal Cookson MR, Annu, Rev. Biochem., 2005

Alpha synuclein Unstructured protein Partially folded intermediates Flexibility and changes in secondary structure are essential for the conformational rearrangements driving the formation of aggregated states Uversky VN et al., Annu. Rev. Biophys, 2008 Soto C. et al., Nat, Rev. Neurosci., 2003

Overview Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs (Latawiec D. et al., PLoS ONE, 2010) Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

PD pathogenesis x x Soto C. et al., Nat, Rev. Neurosci., 2003 Bisaglia M. et al., J. Biol. Chem., 2007

Structural basis of the inhibition Molecular dynamics (MD) simulations based on α-syn’s nuclear magnetic resonance (NMR) structural ensemble: nonspecific hydrophobic contacts between dopamine (DOP) and its oxidation derivatives with the C-terminal; (125YEMPS129 region) Conway KA. et al., Science., 2001 Norris EH et al., J. Biol. Chem., 2005 long-range electrostatic interactions with residues in the NAC region which are involved in the fibrillization process (E83) Herrera FE. et al., Plos ONE., 2008

Aim of the work Molecules structurally and electrostatically similar to a given ligand might provide similar structure/activity relationships Bostrom J et al., J. Med. Chem., 2006 Screening of ligands structurally and electrostatically similar to DOP Study of their binding to a-synuclein through MD simulations

Methods Initial protein structures NMR studies based on paramagnetic relaxation enhancement (PRE) Vendruscolo M., personal communication Dedmon MM et al., J. Am. Chem. Soc., 2005 Cluster analysis (Micheletti C. et al., Proteins, 2000) 6 representative structures Ligand selection Ligand.info database (von Grotthuss et al., Comb. Chem. High Throughput Screen., 2004) 60 molecules selected (10 for DOP and each derivative) Shape and electrostatic similarity (Tanimoto T.. IBM Internal Report, 1957) 5 commercially available ligands

Methods Docking 30 adducts with new ligands + Initial protein structures Docking 30 adducts with new ligands + 36 adducts with DOP and its oxidized products (Morris et al., J. Comp. Chem., 1998) 6 representative structures Ligand selection

Methods Investigate structural stability by Molecular Dynamics (MD) Standard MD setup: NAMD code Amber force field (parm99.dat) Resp parametrization of ligands Timestep 2 fs TIP3P water model with PBC NPT ensemble, 300 K (1 bar) SHAKE algorithm Particle Mesh Ewald (10 Å) Atoms: ~ 50.000 Experimental studies – in vitro fibrillization essays (G. Legname and S. Gustincich, SISSA/ISAS, Italy)

Results – Molecular Dynamics (Kcal/mol) (Kcal/mol)

Results – Molecular Dynamics (Kcal/mol) (Kcal/mol) Test in vitro Strongest effect on fibrillization?

Results – In vitro fibrillization essay

Results – AFM analysis of aggregation mature fibrils >0.75 mm intermediate fibrils 0.5-0.75 mm short fibrils (or protofibrils) <0.5 mm No fibrils, only spherical structures 5-hydroxyindole 5-hydroxyindole 4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole 6-aminoindole a-syn only a-syn + DOP 2-amino-4-tertbutylphenol tyramine a-syn only

Results – TEM analysis of aggregation a-syn alone: fibrils in cluster and longer than 0.75 mm 5-hydroxyindole: cluster of shorter fibrils 6-aminoindole: individual stuctures, early stage of fibrillization

Conclusions 5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization Experimental tests: - Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases; - 6-aminoindole = strongest inhibitory effect - 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect - Morfology analysis by AFM different length and distribution - Ultra-structural analysis for 6-aminoindole: - fibrils more isolated - after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al., 2008) consistently with MD predictions

Overview Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs (Latawiec D. et al., PLoS ONE, 2010) Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

Known isoforms Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 A T S N L M N Polymeropoulos MH et al., Science, 1997 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 A T Mouse a-syn Rat a-syn 1 Rat a-syn 2 S N L M N G A Y Rat a-syn 3 Human a-syn 140 Human a-syn 126 DN GS Human a-syn 112 Human a-syn 98 Adapted from MacLean PJ et al., Neurosci. Lett., 2002

Alpha synuclein – isoform D2 Lab. Prof. S. Gustincich, SISSA 100-140 116-140 127-140 3 possible peptides a-syn N-term a-syn C-term D2 Empty Full-length Structural correlation with full-length alpha-synuclein? Identificazione d2 tramite 3’race Demonstrated the production oif the peptide in vivo tramite immunofluorescence este osservazioni potrebbero fornire una nuova chiave di lettura per i risultati ottenuti dall’analisi del modello di differenziamento neuronale, basato sulla linea cellulare MN9D. Durante lo studio era stata osservata, per immunofluorescenza, l’espressione proteica dell’α-sinucleina dopo 96 ore dall’induzione del processo differenziativo (Figura 4.12), in corrispondenza del picco di espressione del trascritto misurato con la coppia di primers disegnata sul quarto esone (Figura 4.13). In considerazione del fatto che quest’ultimo, ipotizzato essere costituito anche da tutte le varianti tronche del trascritto, risulta essere considerevolmente più espresso della forma full length del trascritto (Figura 4.15), si potrebbe ipotizzare che quanto osservato per immunofluorescenza non corrisponda all’α-sinucleina di lunghezza completa, ma rappresenti invece il peptide 99-140. L’analisi è stata, infatti, condotta con il solo anticorpo diretto contro la regione C-terminale, noto per riconoscere l’isoforma Δ2, ed incapace di discriminare tra il peptide e l’intera proteina. Se tale ipotesi fosse confermata, ad esempio ripetendo l’analisi di immunofluorescenza con anche l’impiego di un anticorpo diretto contro la porzione amino-terminale della proteina, si potrebbe validare la teoria secondo cui queste molecole siano codificanti e formulare ulteriori ipotesi circa un loro ruolo nel processo differenziativo. In considerazione di quanto detto, sulle proprietà della porzione carbossi- terminale di attenuare il processo aggregativo e fibrillogenico dell’α-sinucleina, una valutazione dei livelli trascrizionali di queste isoforme tronche, potrebbe essere importante per la malattia di Parkinson. Ab againts asyn N-term non lega D2!!!

Chirality index (G) Pietropaolo A. et al., Proteins, 2008 dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms Istantaneous values along MD trajectories Flexibility In this purpose, besides well defined tools that capture conformational features, a recently developed chirality index is used. (Pietropaolo et al., 2008) which consists in dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms coordinates; the instantaneous value of the index can then be compared with the characteristic values for ideal secondary structures. The chirality index would change during the simulation if the protein is flexible and change its secondary structure, so this index can be used to understand the flexibility of the protein This methodology is based on the assignment of a chirality parameter (G) to short amino acid sequences according to their spatial arrangement, and it has been demonstrated to be stable with respect to random conformational perturbation and more efficient then classical algorithms such as STRIDE and DSSP in the recognition of structural motifs of a protein. Furthermore, the values of G are assigned dynamically along MD trajectories, allowing to follow the conformational changes over time. These instantaneous values of can be compared with the characteristic values for ideal secondary structures (Table 2, Fig. 1). Finally, the chirality index provides also an indication about the local flexibility of the protein, both through the change of its values over time and its standard deviation (SD), which turns out to be a direct measure of the flexibility of the region. Since 0.01 is the mean SD, regions with lower SD are considered with low flexibility.

Coil states have a chiral nature Pietropaolo A. et al., submitted Coil states: absence of correlation among consecutive f and y dihedrals Smith L. et al., Fold. Des., 1996 Chirality index particularly suitable because is calculated on 5aa-fragments Defined chirality in coil states is important in disordered proteins Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a random orientation

6 mouse alpha-synuclein conformations Computational procedure A T S N L M N G A Y DN GS MD  30 ns/conformation  180 ns 6 mouse alpha-synuclein conformations

Cluster analysis (10 Å cutoff) Chirality index and standard deviation Results – Molecular dynamics (full-length) RMSD Cluster analysis (10 Å cutoff) Chirality index and standard deviation

Results – Peptides G – 60 ns G – 120 ns G – 180 ns SD – 180 ns

Discussion carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A. et al., Biochemistry, 2003) Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production? homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K., Acta Neuropathol. 2006) Regulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W. et al., Biochemistry, 2004) Binding to other proteins or cationic compounds Alpha-synuclein (alpha-syn) is the major component of intracellular inclusions in several neurodegenerative diseases, and the conversion of soluble alpha-syn into filamentous aggregates may contribute to disease pathogenesis. Since mechanisms leading to the formation of alpha-syn inclusions are unclear, in vitro models of alpha-syn aggregation may yield insights into this process. To that end, we examined the consequences on the progressive deletion of the carboxy-terminus of alpha-syn in regulating fibril formation, and we show here that carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule. Protease digestion and immunoelectron microscopy indicate that the alpha-syn amino- and carboxy-termini are more solvent exposed than the central core and that filaments formed from carboxy-terminal truncated alpha-syn are narrower in diameter than the full-length molecule. Moreover, seeding experiments under conditions where full-length alpha-syn did not readily aggregate revealed that carboxy-truncated alpha-syn extending from amino acids 1-102 and 1-110 but not 1-120 were efficient in seeding full-length alpha-syn aggregation over a range of concentrations. Using site-directed mutagenesis, the negatively charged residues 104, 105 and 114, 115 in the carboxy-terminus were implicated in this reduced aggregation and the lack of seeding of full-length alpha-syn fibrillogenesis by 1-120. Our data support the view that the middle region of alpha-syn forms the core of alpha-syn filaments and that negative charges in the carboxy-terminus counteract alpha-syn aggregation. Thus, the carboxy-terminus of alpha-syn may regulate aggregation of full-length alpha-syn and determine the diameter of alpha-syn filaments. Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility, having a protecting role

In progress: influence of mutations S87N L100M N103G A107Y D121G N122S Study of combined mutants: A53T + G – 180 ns

In progress: “Fold factor” Pietropaolo A. et al., submitted Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations Conditional probability A complex problem in computational biology stays in predicting how folded a particular protein is. In these regards, a score function is usually estimated depending on how many residues fall inside the regions belonging to the Ramachandran maps19. However, Ramachandran maps loose sensitiveness facing high flexible states. We have developed a fold parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations. Pdataset+ normalized occurrence in the dataset (Xray and NMR) of having, for an amino acid i + 1, a given value of chirality Gi+1 once6fixed the type of the preceding amino acid i and its chirality index to Gi, for all twenty amino acids All correlation maps

NGF-TrkA

Thanks Lab. Prof. Legname (SISSA) Lab. Prof. Gustincich (SISSA) Pietropaolo (UniCT) Prof. Carloni (GRS)

La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche, a partire da un’isoforma di splicing alternativo, costituirebbe un’eventualità molto interessante. Una delle modifiche post-traduzionali a cui l’α- sinucleina è soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale, che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti all’aggregazione ed alla fibrillazione *Murray et al. 2003]. Lo studio di questa modifica post-traduzionale si è sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina, quella rimanente al N-terminale, ma non si è mai indagato sul peptide generato dal taglio. Se questo peptide fosse prodotto in vivo, si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dall’α-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore. In considerazione dell’omologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006], si può ipotizzare che questo peptide possa svolgere un’attività simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici, in virtù del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al. 2004].Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro, un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa l’attività funzionale del trascritto Δ2. Per poter effettuare questa valutazione, si è reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per l’espressione in cellule eucariotiche, pcDNA 3.0. All’interno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per l’esone due, sia quella full length dell’α-sinucleina, a partire dal primo esone distale.

4.3.1.2 L’analisi per immunofluorescenzaL’indagine per immunofluorescenza, oltre a consentire una valutazione qualitativa dell’espressione proteica, è primariamente finalizzata alla stima dell’efficienza di trasfezione, la quale risulta essere all’incirca del 70%, con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleina.Per eseguire questa analisi, le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 1.6 μg di DNA. Al termine delle 24 ore, le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono, quindi, state incubate con due diversi anticorpi, i quali, pur essendo entrambi capaci di riconoscere l’α-sinucleina, differiscono per la regione di legame. Dal momento che la forma Δ2 rappresenta l’ultima parte della proteina, un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 4.24) sarà in grado di riconoscere sia questo peptide, sia la forma FL. Se si impiega, invece, un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 4.24), solo l’isoforma intera dell’α-sinucleina potrà essere riconosciuta.Le immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo all’isoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate.

4.3.1.3 L’analisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato, si prosegue l’indagine dell’espressione proteica in vitro dell’isoforma di splicing Δ2, mediante Western Blotting. Per questo studio, sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T, coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto, di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate ed è stato raccolto l’estratto proteico totale, con cui è stata effettuata l’analisi di Western Blotting.Per visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina è stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale. La differenza di peso molecolare risulta, infatti, sufficiente a discriminare tra le due, che pesano rispettivamente 17 kDa, la forma completa, e 4,6 kDa, la variante Δ2.Come si osserva in figura 4.25, solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale all’altezza corrispondente all’isoforma di splicing. Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare, ad esempio utilizzando gel a gradiente, membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalità di blotting, nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse.

In considerazione dell’omologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006], si può ipotizzare che questo peptide possa svolgere un’attività simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici, in virtù del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al. 2004].

Questa seconda eventualità risulterebbe di grande interesse, perché potrebbe suggerire per questi peptidi un’attività simile agli chaperoni, in considerazione dell’alta omologia strutturale di questa regione dell’α-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni. È stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dell’α-sinucleina, dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina, mancanti proprio dell’estremità C-terminale, maggiormente prone al processo fibrillogenico. Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione, si potrebbe immaginare che l’espressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson, per l’attenuazione del processo aggregativo dell’α-sinucleina.

In particular, Alanine map [a] shows a high correlation, with a strong minimum centered at negative values, typical of α helix and in lower extent less positive values. Proline residue possesses a spread map [b], showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation. The map of methionine, recently reported to interplay protein–protein interactions20, shows an extra–diagonal peak at [+0.15, +0.03] values of chirality index, as inferred from Figure 2[c], which is absent in the cysteine map of Figure 2[d].

Once all the correlation maps of native chirality are obtained, we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures, as expressed in the following:kT NGdataset Fold factor = NG 􏰁i=1 −logP(Gi+1,Gi,AA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone, dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 0.6 Kcal/mol at 300 K. P(Gi+1,Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i, with Gi+1 and Gi values, in the correlation maps of native chirality. Since we are summing energy quantity, the probability taken into account are not conditional, like those reported in Figure 2 [a]-[d], but normalized as conventional joint probability.

Random structures of lysozyme, instead, show high values, whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi, Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values. Supporting its effectiveness, the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor, comparable to that one of SCOP classes. Moreover, an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies, in accordance with the recent contribution of Liu et al.21. The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme, which indicates a dynamical but not random conformational ensemble.