Coltura Primaria Coltura a Breve Termine Coltura a Lungo Termine < 10 duplicazioni 50/60 duplicazioni

Coltura Secondaria Linea Cellulare Continua >150/200 duplicazioni

Linea Cellulare Continua E’ capace di crescere indipendentemente dall’organismo originale da cui è derivata Crescita ininterrotta per oltre 1 anno Immortale

Linea Cellulare Continua Subclone derivata dalla linea cellulare parentale, ma con caratteristiche divergenti/uniche Linee Sorelle Simultanee stabilizzate da differenti siti dello stesso organismo il campione primario è stato suddiviso in più aliquote prima della semina Linee Sorelle Seriali stabilizzate dallo stesso organismo, ma in differenti momenti (ad esempio alla diagnosi ed alla recidiva)

Stabilizzazione di Nuove Linee Cellulari Estremamente Difficile Rari Successi e Non Prevedibili Importanza delle Aberrazioni Cromosomiche e/o Mutazioni Genetiche Diagnosi vs Ricaduta: diverse percentuali di successo

The leukemia-Lymphoma Cell Line FactsBook di H.G. Drexler, 2000 Scarsa riproducibilità della metodica in altri laboratori The leukemia-Lymphoma Cell Line FactsBook di H.G. Drexler, 2000

IN VIVO La pressione parziale di ossigeno nei normali fluidi corporei è significativamente più bassa di quella dell’aria. Nel midollo osseo umano è di circa il 2-5%. EX VIVO La pressione parziale di ossigeno negli incubatori al 5% di CO2 è di circa 15-20%!!! In alcuni casi è utile ridurre la fase gassosa di ossigeno tra 1-10%. Alcune linee cellulari crescono al 5% di ossigeno ed il 6% di anidride carbonica. Incubatore

Deterioramento della Coltura Le cellule neoplastiche cessano di proliferare Overgrowth di fibroblasti o macrofagi Overgrowth di cellule linfoblastoidi EBV+ Possibili ragioni B

LA STABILIZZAZIONE DI UNA NUOVA LINEA CELLULARE: PUNTI CRITICI Medium di coltura: RPMI 1640, IMDM, McCoy’s, Alpha MEM e DMEM Fattori di crescita: EPO, G-CSF, GM-CSF, IL-2, IL-3, IL-6, SCF, PHA e CM Supporto colturale (plastica) Concentrazione cellulare Superamento della crisi di stabilizzazione LA STABILIZZAZIONE DI UNA NUOVA LINEA CELLULARE: PUNTI CRITICI

Cloruro di calcio anidro Solfato di magnesio anidro Cloruro di potassio Nitrato di potassio Cloruro di sodio Fosfato di sodio bibasico Bicarbonato di Sodio Medium di Coltura “Ioni Inorganici”

“Aminoacidi-Isomeri L” Alanina Arginina Asparagina Acido Aspartico Cisteina Glutamina Acido Glutamico Glicina Istidina Isoleucina Medium di Coltura “Aminoacidi-Isomeri L” Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptofano Tirosina Valina

Medium di Coltura “Vitamine” Biotina Pantotenato Acido Folico Inositolo Nicotinamide Piridossina Riboflavina Tiamina Vitamina B12 Medium di Coltura “Vitamine”

Medium di Coltura “Altri Componenti” Glucosio Hepes Rosso fenolo Sodio Piruvato Siero fetale bovino (10%-20%) Aminoacidi non-essenziali Medium di Coltura “Altri Componenti”

Sistema Tampone Metaboliti Alterazione del pH Rallentamento della crescita Morte cellulare E’ essenziale che il pH sia controllato attraverso un Sistema Tampone BICARBONATO-ANIDRIDE CARBONICA

BICARBONATO-ANIDRIDE CARBONICA Il sistema è costituito dal bicarbonato di sodio (oppure di potassio), presente in qualità di nutriente del medium, e dall’anidride carbonica presente nell’atmosfera degli incubatori a CO2 H2O+CO2 H2CO3 H+ + HCO3- NaHCO3 Na+ + HCO3- pH alcalino del medium: viene corretto dalla formazione di ioni carbonato (che si formano a seguito della ionizzazione dell’acido carbonico derivato a sua volta dalla dissoluzione in acqua della CO2) pH acido del medium: viene corretto dalla formazione di bicarbonato di sodio (che deriva dall’eccesso di carbonato) L’equilibrio tra carbonato e bicarbonato di sodio è mantenuto nel medium di coltura grazie alla presenza della CO2 Il pH è mantenuto tra 7 e 7.4 nel medium di coltura

Supporto Colturale E’ noto che alcuni tipi cellulari necessitano di supporti specifici. Ne è un esempio la coltura di cellule staminali embrionali murine: Piatre Petri da 35,60 e 100 mm: Falcon Fiasche e Multiwell: Nunc Methods in Molecular Biology, Vol. 185, Casa Editrice Humana Press