LINEA PROGETTUALE 5 Valutazione degli effetti tossicologici dellaria prelevata in prossimità degli impianti di incenerimento

LP5 – Valutazione degli effetti tossicologici dellaria prelevata in prossimità degli impianti di incenerimento Modelli in vitro per la valutazione della risposta infiammatoria Studio dellimpatto ambientale da sostanze genotossiche derivanti dallattività degli impianti di incenerimento Modelli in vitro predittivi del rischio cancerogeno Approcci di tossicogenomica per lindividuazione di profili genici di espressione in linee cellulari esposte al particolato Valutazione dl rischio cancerogeno Arpa ER – Laboratorio tematico Mutagenesi Ambientale Arpa ER – Centro tematico regionale Cancerogenesi Ambientale e Valutazione del Rischio Università di Bologna – Dipartimento Patologia Sperimentale – Sezione Cancerologia Università di Ferrara – Dipartimento di Medicina sperimentale e diagnostica Università di Parma – Dipartimento di Genetica, biologia dei microorganismi, antropologia, evoluzione Responsabile: dott. Annamaria Colacci

Cosa e stato indagato Base razionale –Lesposizione a contaminanti ambientali può innescare una serie di eventi che si traducono in effetti a carattere acuto o cronico –La risposta immediata è di tipo infiammatorio –Gli effetti acuti, al perdurare dellesposizione, tendono a cronicizzarsi e a creare un ambiente ideale per linsorgenza di effetti più gravi e a lungo trmine Domande –È possibile tracciare a livello biologico e molecolare le diverse fasi delleventuale risposta a una esposizione ambientale puntiforme, quale quella rappresentata da un inceneritore? –E possibile identificare marcatori di esposizione precoci che potessero esser utili in una predizione del rischio per la salute umana?

Cosa e stato indagato AZIONE 1 AZIONE 1 2 AZIONE 2 3 AZIONE 3 4 AZIONE 4 5 AZIONE 5

S. Pietro Capofiume (fuori dominio) NE 44.6, 11.6 Calamosco Giardini Frullo EST Veduro F19 Frullo Ovest Pianeta Rurale FrulloBianco vs Urbano Analisi tossicologica: i confronti

Gli esiti del confronto I risultati ottenuti nella LP5 sono concordi nel mostrare un profilo tossicologico simile nei campioni di aria prelevati nel sito di massimo impatto dellinceneritore (Frullo Est) e nel sito appartenente allo stesso dominio, ma non interessato dalla ricaduta dei fumi dellimpianto (Calamosco). Molti indici, anzi, imputano al sito Calamosco unattività tossicologica più elevata. Sulla base dei risultati ottenuti si può concludere che linceneritore oggetto di questo studio non incrementa il rischio da esposizione a aria inquinata

Fondamenta delle conclusioni Lanalisi tossicologica

Azione 5

Il materiale raccolto per lanalisi tossicologica I campioni analizzati Per ogni sito di raccolta, e stato ottenuto un unico campione per stagione derivato dallestrazione in acetone di tutti i filtri

Endpoint misurati

Gli endpoint biologici: infiammazione

La risposta infiammatoria Figura 7 - Studio comparativo dellattività di rilascio di IL-1beta stimolata da particolato raccolto nei quattro siti prescelti. Monociti sono stati isolati dal sangue periferico di donatori, incubati in piastra (5 x 10 5 /ml/piastra, 24 piastre) per 5 giorni e poi esposti a particolato alle concentrazioni di 80, 160, 320 µg/ml per 6 ore, I dati sono riportati come media di 3 repliche per punto per 2 donatori (totale 6 repliche) Risposta Infiammatoria monociti primari di donatori sani Rilascio di ATP e di IL1-beta Le molecole ricercate sono rilasciate come risposta immediata a uno stress cellulare

Mutagenesi - Ames Figura 9 – Comparazione degli effetti mutageni dei campioni invernali Differenze non significative nellambito dello stesso ceppo batterico Danno genetico Salmonella typhimurium (Test di Ames) RetromutazioniE il test di elezione per individuare linduzione di mutazioni puntiformi

mutagenesi - COMET Figura 10 - Studio comparativo dellattività mutagena (Test della cometa) di particolato raccolto nei quattro siti prescelti. Leucociti di donatori sani (10 6 leucociti/piastra) sono stati incubati con concentrazioni scalari (1.25, 2.5, 5 m 3 ) di estratto per 1 h. Il DNA da cellule lisate, sottoposto a corsa elettroforetica su vetrino e marcato con bromuro di etidio viene osservato in fluorescenza. Il valore quantitativo del danno è dato dal coefficiente angolare delle rette di regressione dose-effetto dei campioni positivi e di quelli che presentano, comunque, un R 2 0,60. La significatività viene calcolata rispetto al controllo non trattato tramite test della mediana Supersite = Frullo EST Danno genetico rotture a singolo e/o doppio filamento del DNA e siti in cui la struttura del DNA è deformata Evidenzia danno primario a carico del DNA nelle singole cellule non ancora riparato, né fissato. rotture a singolo e/o doppio filamento del DNA e siti in cui la struttura del DNA è deformata

Mutagenesi - Micronucleo Figura 11 - Studio comparativo dellattività mutagena (test del micronucleo) di particolato raccolto nei quattro siti prescelti. Linfociti di donatori sani (10 5 leucociti/piastra) sono stati incubati con concentrazioni scalari (0, 3, 6, 12 m 3 ) di estratto in due repliche indipendenti. Supersite = Frullo EST Danno genetico Micronucleo in linfociti periferici Formazione di micronuclei (frammentazione del nucleo) Evidenzia rotture dei cromosomi (sostanze clastogene) o perdita dei medesimi (sostanze aneugeniche)

Cancerogenesi in vitro Lendpoint di citotossicità misura il grado di sopravvivenza della cellula alleffetto tossico acuto del trattamento Estate 2008Inverno 2009 Figura 12 – Effetti citotossici misurati in cellule BALB/c 3T3 dopo esposizione a particolato raccolto nei quattro siti prescelti. Le cellule (250 cellule/piastra) sono state incubate per 48 ore con concentrazioni scalari di estratto. I dati sono riportati come numero di colonie per piastra w sono una media (±ES) di 5 repliche. Significatività statistica: * p<0.05, vs controllo solvente, Student t test; ** p<0.01, vs controllo solvente, Student t test.

Cancerogenesi in vitro AB Figura A3 - Piastre di un esperimento di trasformazione. A – controllo negativo - cellule trattate con il solvente (DMSO). B – controllo positivo - cellule trattate con il cancerogeno (3-MCA) Figura A4- Focus ottenuto per trattamento con il cancerogeno (3-MCA) (ingrandimento 40x)

cancerogenesi in vitro Figura 13 – Frequenza di trasformazione in cellule BALB/c 3T3 dopo esposizione a particolato raccolto nei quattro siti prescelti. Le cellule ( cellule/piastra) sono state incubate per 48 ore con concentrazioni scalari di estratto. I dati sono riportati come Trasformation frequency (TF) un indice ricavato dal numero di foci maligni di origine monoclonale riscontrato in ogni trattamento per il numero delle cellule a rischio (cellule sopravvissute alleffetto tossico acuto dellestratto). Significatività statistica: ** p<0.01, vs controllo solvente,, Poisson rates comparison MCA = 3-metilcolantrene, utilizzato come controllo positivo (cancerogeno) alla concentrazione di 2.5 µg/ml/piastra Estate 2008Inverno 2009

Gli endpoint biomolecolari: trascrittomica (profili genici) Tossicogenomica –(disciplina) studia in quale modo il genoma di un organismo risponde ai fattori ambientali di stress e agli inquinanti. –combina la tossicologia con la genomica per comprendere il ruolo delle interazioni gene-ambiente nella insorgenza dei disturbi e delle patologie legate a specifiche esposizioni Trascrittomica –Una delle tecnologie omiche della tossicogenomica –Mediante lutilizzo della tecnica di DNA microarray si valuta la variazione di espressione di migliaia di geni (lintero genoma che, a seconda dellorganismo, va da qualche migliaio di geni a decine di migliaia) in cellule che siano state esposte a singoli composti, chimici, miscele complesse di composti o, come nel caso di questo studio, a estratti di matrici ambientali. –Con questo approccio è anche possibile identificare il modo dazione o il meccanismo dazione di composti chimici. Ogni esposizione determina uno specifico profilo trascrizionale, cioè un certo numero di geni che risulta differentemente espresso in seguito allesposizione

Gli endpoint biomolecolari: trascrittomica (profili genici) esposizione

Gli endpoint biomolecolari: profili genici

Gli endpoint biomolecolari : profili genici di cellule T47D Figura 15 - Analisi delle componenti principali (PCA) in cellule T47D esposte agli estratti di particolato raccolto in tre siti prescelti. I dati sono il risultato di tre repliche biologiche. Il controllo è rappresentato da cellule non trattate FES CS GMS GMW FEW CW

. Frullo Est e Calamosco differiscono tra loro per un numero esiguo di geni, mostrando, anche in questo approccio biomolecolare, che i campioni daria raccolti in questi due siti hanno un profilo tossicologico sostanzialmente simile e differiscono in egual misura dal profilo identificato per il campione Giardini Margherita Gli endpoint biomolecolari : profili genici di cellule T47D

I risultati danno evidenza che la gran parte dei processi modulati sia in FrulloEst che in Calamosco si raggruppano nei seguenti percorsi biologici: –Attivazione del sistema immunitario e della risposta infiammatoria, –Regolazione della coagulazione ed emostasi –Modulazione di processi di regolazione della crescita cellulare. Gli endpoint biomolecolari : profili genici di cellule T47D

HuMI – ha risentito del forte effetto citotossico degli estratti in esame, che ha determinato uno spegnimento a carico di molti geni, tanto da non risultare particolarmente informativa. Infatti, gia dopo solo 4 ore di trattamento con la dose 8 m 3 leffetto trascrizionale prevalente nella popolazione cellulare trattata è quello di un massiccio arresto della proliferazione dovuta allinsulto tossico. A549, –citotossicita indotta dagli estratti e stata piu modesta, e l inibizione trascrizionale ha riguardato solo certi processi biologici relativi alla migrazione leucocitaria nei tessuti e ai sistemi di adesione tra cellule. –E inoltre rilevante sottolineare che il solo trattamento con lestratto di Calamosco comparato a G. Margherita interferisce con lassemblaggio della cromatina, processo questo che viene riportato come significativo nella risposta a forti contaminazioni ambientali in bambini che vivono in zone altamente impattate dalla presenza di miniere di carbone. BALB/c 3T3, –è stato evidenziato un maggior effetto tossico da parte di Calamosco, attivati con una attivazione anche dei marcatori di morte cellulare per apotosi. Gli endpoint biomolecolari: altre linee cellulari

Fondamenta delle conclusioni La valutazione del rischio cancerogeno

La valutazione del rischio tossicologico La valutazione del rischio si basa sullutilizzo di modelli predittivi che consentono di stimare la probabilità che, in seguito a una specifica esposizione, un effetto avverso si verifichi in misura maggiore di quanto non accade in assenza di tale esposizione Questo concetto di eccesso di rischio sottolinea che la linea di partenza non corrisponde mai al rischio zero (assenza di rischio).

Tossicità e rischio: le definizioni secondo lOCSE Toxicity (= tossicità) –Capacità intrinseca di un composto chimico o di una miscela di sostanze di indurre danno Hazard (= pericolosità) –Manifestazioni tossiche osservate indotte una quantità nota di una sostanza in condizioni note di esposizione Tossicità intrinseca Risk (rischio) –Probabilità che un pericolo (o più pericoli) identificato(i) si possa realizzare in condizioni di esposizione prevedibili –Risk = Hazard x Exposure

La valutazione del rischio tossicologico –Stima del rischio cancerogeno UR (unità di rischio) (o potenza o hazard), –numero di tumori in eccesso attesi entro una certa dimensione di popolazione come conseguenza di una esposizione quotidiana per tutta la vita a una dose unitaria del cancerogeno. – Ci si basa sulla reale esposizione giornaliera, misurata o stimata (esposizione = E). Il rischio è pertanto dato da: UR x E. Rischio in eccesso non deve superare 1 x 10- 6

Rischio di cancro PM 2.5 EstateInverno B(a)P Frullo est1.10 x x10 -7 Calamosco1.43 x x10 -7 Frullo ovest1.21 x x10 -7 F x x10 -7 Castenaso1.32 x x10 -7 Margherita0.99 x x10 -7 Pianeta1.76 x x10 -7 Veduro0.44 x x10 -7 I microinquinanti: IPA e NitroIPA (risultati) Rischio di cancro PM 2.5 EstateInverno B(a)P eq Frullo est0.93 x x10 -4 Calamosco0.58 x x10 -4 Frullo ovest0.75 x x10 -4 F x x10 -4 Castenaso0.61 x x10 -4 Margherita0.51 x x10 -4 Pianeta0.61 x x10 -4 Veduro0.42 x x10 -4 Fattori di equivalenza (Potency Equivalence factors, PEF) derivanti da studi di cancerogenesi nei piccoli roditori dove disponibili, correlano il potenziale cancerogeno di IPA e NIPA a quello del Benzo(a)pirene [B(a)P] pari a 1 Potenza cancerogena è stimata sulla base della somma dei valori trasformati in B(a)P equivalenti di ogni singolo componente

I microinquinanti: Diossine e PCB WHO (World Health Organization) –TDI –2 pg/kg p.c./die – assunzione massima senza effetti sia tossico-riproduttivi (a soglia) che cancerogeni (la TCDD è un promovente) USA –cancerogeno con relazione lineare tra dose e risposta e quindi senza soglia –UR = 3.8 x10 -5 per assunzione di 1 pg TCDD/mc/die per tutta la vita. PCDD and PCDFWHO-TEF (1998)WHO-TEF (2005) 2,3,7,8-TCDD11 1,2,3,7,8-PnCDD11 1,2,3,4,7,8-HxCDD0.1 1,2,3,6,7,8-HxCDD0.1 1,2,3,7,8,9-HxCDD0.1 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD0.01 OCDD ,3,7,8-TCDF0.1 1,2,3,7,8-PnCDF ,3,4,7,8-PnCDF ,2,3,4,7,8-HxCDF0.1 1,2,3,6,7,8-HxCDF0.1 1,2,3,7,8,9-HxCDF0.1 2,3,4,6,7,8-HxCDF0.1 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF0.01 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF0.01 OCDF PCB (n. IUPAC) 3,4,4',5-TCB (81) ,3',4,4'-TCB (77) ,3,4,4',5-PnCB (123) ,3',4,4',5-PnCB (118) ,3,4,4',5-PnCB (114) ,3,3',4,4'-PnCB (105) ,3',4,4',5-PnCB (126)0.1 2,3',4,4',5,5'-HxCB (167) ,3,3',4,4',5-HxCB (156) ,3,3',4,4',5'-HxCB (157) ,3',4,4',5,5'-HxCB (169) ,3,3',4,4',5,5'-HpCB (189)

I microinquinanti: Diossine e PCB Rischio di cancro PM 2.5 EstateInvernoEstateInverno PCB totaliTCDD+PCDF+DL-PCB TCDD eq Frullo est4.27 x x x x10 -7 Calamosco3.59 x x x x10 -7 Pianeta4.20 x x x x10 -7

Considerazioni conclusive I risultati ottenuti nella LP5 sono concordi nel mostrare un profilo tossicologico simile, anche se non completamente identico, nei campioni di aria prelevati nel sito di massimo impatto dellinceneritore (Frullo Est) e nel sito appartenente allo stesso dominio, ma non interessato dalla ricaduta dei fumi dellimpianto (Calamosco). Molti indici, anzi, imputano al sito Calamosco unattività tossicologica più elevata. Anche lanalisi dei microinquinanti rilevati in tutti i siti dove è stata eseguita la raccolta dei campioni e la caratterizzazione chimica del particolato non mostra situazioni preoccupanti legate alla predizione di un eccesso di rischio di tumori imputabili allattività dellimpianto di incenerimento.

Considerazioni conclusive Ci sono rischi per la salute della popolazione attualmente residente nelle aree interessate dallinceneritore di Bologna (Frullo)? –Dai risultati di questo studio, linceneritore non incrementa il rischio da esposizione a aria inquinata. E possibile applicare questi risultati ad altri inceneritori? –Sì, se questi inceneritori hanno la stessa tecnologia dellinceneritore studiato Che significato ha questo studio? Si può considerare completo e definitivo? –Applicando test e procedure internazionalmente riconosciuti per valutare la pericolosità delle sostanze, abbiamo delineato un metodo sensibile e specifico che potrà essere applicato in futuro per leventuale monitoraggio degli inceneritori e per studiare nuove, eventuali, situazioni di esposizione.