Il percorso del campione dal prelievo al referto U.O. ANATOMIA PATOLOGICA Il percorso del campione dal prelievo al referto Diagnosi cito-istologica e Marcatori biomolecolari Rossana Culli 08/06/2013

Il percorso del campione dal prelievo al referto FASE PRE-ANALITICA FASE ANALITICA FASE POST-ANALITICA

FASE PRE-ANALITICA PRELIEVO DEL MATERIALE DA ESAMINARE ALLESTIMENTO inizia al momento del prelievo e si completa in laboratorio a opera del personale tecnico di Anatomia Patologica TRASPORTO dal punto di prelievo al laboratorio

In questa fase si annidano numerosi punti critici : * insufficienza del materiale prelevato * presenza di una quantità eccessiva di sangue o di flogosi,che offuscano il preparato * contaminazione con talco che può mimare la presenza di cellule neoplastiche * scorretto allestimento dei preparati(vetrini mal strisciati mal fissati in cui le cellule si presentano danneggiate e non valutabili) * trasporto ritardato del materiale fresco. Molte di queste criticità sono superabili usando procedure e metodiche corrette.

flogosi-necrosi

Brushing bronchiale: Inquinamento da cristalli di talco

TECNICA CORRETTA ALLESTIMENTO AGOASPIRATI

TECNICHE DI FISSAZONE CON CITOSPRAY

Agoaspirato polmonare: Artefatti di allestimento

Caso precedente Strato sottile su lavaggio dell’ago

ESAMI ISTOLOGICI inclusione in paraffina BIOPSIE DA SEDI DIVERSE IN CORSO DI FIBROBRONCOSCOPIA AGOBIOPSIE POLMONARI TC GUIDATE BIOPSIA: fissazione in formalina inclusione in paraffina allestimento di sezioni microscopiche colorazione con ematossilina-eosina

In corso di broncoscopia ESAMI CITOLOGICI In corso di broncoscopia Broncoaspirato-lavaggio-espettorato Metodica “ CITOINCLUSO” Fissazione in alcool 95° Inclusione in paraffina Allestimento sezioni microscopiche Colorazione con ematossilina –eosina Vantaggi: conservazione di tutto il materiale possibilità di allestire preparati per immunocitochimica e di eseguire metodiche di biologia molecolare

Brushing il materiale prelevato viene strisciato sul vetrino, fissato con citospray e colorato con Papanicolaou Agoaspirato transcarenale/intralesionale striscio convenzionale strato sottile lo strato sottile offre un fondo pulito, permette di conservare il materiale per 30 giorni, di allestire preparati per immunocitochimica e di eseguire metodiche di biologia molecolare.

in corso di agobiopsia percutanea ESAMI CITOLOGICI in corso di agobiopsia percutanea TC guidata Agoaspirato (FNA) Striscio convenzionale Strato sottile Valutazione estemporanea adeguatezza del materiale si esegue su uno o due vetrini convenzionali inviati immediatamente dopo il prelievo e colorati con una metodica rapida.

in corso di toracentesi ESAMI CITOLOGICI in corso di toracentesi Liquido pleurico Dal materiale inviato “a fresco” * si allestiscono 6 vetrini con citocentrifuga si colorano con Papanicoleau, MGG, PAS (colorazioni diverse permettono di valutare diverse caratteristiche cellulari) *se si forma o è presente un coagulo si allestisce un citoincluso * il materiale rimanente viene lasciato nel fissativo liquido per strato sottile per eventuali ulteriori indagini (immunocitochimica –biologia molecolare)

DIAGNOSTICA IMMUNOISTOCHIMICA ESAMI DI BIOLOGIA MOLECOLARE FASE ANALITICA OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO OTTICO DEL MATERIALE OPPORTUNAMENTE PROCESSATO DIAGNOSTICA IMMUNOISTOCHIMICA ESAMI DI BIOLOGIA MOLECOLARE

Referto istologico / citologico conclusione diagnostica FASE POST-ANALITICA Referto istologico / citologico descrizione e conclusione diagnostica

FASE POST-ANALITICA Referto citologico NEGATIVO PER CELLULE MALIGNE INADEGUATO (vedi fase pre-analitica) NEGATIVO PER CELLULE MALIGNE DUBBIO SOSPETTO POSITIVO PER CELLULE MALIGNE

SE METASTATICA DA DOVE VIENE ? In ogni tipo di patologia oncologica ,ma in modo particolare nella diagnostica delle neoplasie toraciche, due sono le questioni fondamentali da affrontare LA NEOPLASIA IN ESAME E ‘ PRIMITIVA ? SE METASTATICA DA DOVE VIENE ? QUAL E’ L’ISTOTIPO DELLA NEOPLASIA ? In entrambi i casi, oltre all’osservazione delle caratteristiche citoarchitetturali della neoplasia ,che rimane il punto fondamentale della diagnostica ,sono di aiuto le metodiche immumocitochimiche .

IMMUNOCITOCHIMICA Si ricercano antigeni presenti nelle cellule tumorali, diversi da neoplasia a neoplasia, tramite anticorpi specifici ai quali è legato un segnale colorato. Se la reazione antigene-anticorpo avviene, cioè se nelle cellule è presente l’antigene cercato, il segnale colorato è visibile al microscopio ottico.

CEA+ Calretinina – …….. Adenocarcinoma CASI ESEMPLIFICATIVI 1) liquido pleurico con cellule chiaramente maligne le cui caratteristiche pongono il problema della diagnosi differenziale fra adenocarcinoma metastatico e mesotelioma Si eseguono indagini mmunocitochimiche usando il pannello costituito dagli anticorpi CEA e Calretinina Risultati possibili: CEA+ Calretinina – …….. Adenocarcinoma CEA- calretinina + ………. Mesotelioma

Può essere di aiuto un pannello costituito da Nel caso adenocarcinoma si pone il quesito dell’origine della neoplasia che può derivare dal polmone, dal colon,dall’ovaio…….. Può essere di aiuto un pannello costituito da citocheratina 20 ,citocheratina 7,ttf1 Risultati possibili ttf1+ citocheratina 7+citotocheratina 20 – Depone per carcinoma del polmone ttf1 –citocheratina 7-citocheratina 20+ Depone per carcinoma del colonretto

Cd56 + neoplasie neuroendocrine Citocheratina 7+ adenocarcinoma 2) Carcinoma primitivo del polmone con alterazioni cellulari poco differenziate,del quale si vuole determinare con la maggiore accuratezza possibile l’istotipo. Cd56 + neoplasie neuroendocrine Citocheratina 7+ adenocarcinoma P63+ carcinoma squamoso 3) Cellule da microcitoma versus linfociti Lca - CD56 + microcitoma Lca+ CD56- linfociti

Liquido pleurico mesotelioma MGG citocentrifuga

Mesotelioma Liquido pleurico Citocentrifuga Calretinina

Mesotelioma liquido pleurico citoincluso calretinina

Adenocarcinoma del polmone espettorato citocheratina 7

Stesso caso P63

LIMITI DELLA METODICA 1)Tumori diversi hanno antigeni in comune (Ck 7+ /20- caratterizza carcinoma del polmone ,ma anche di mammella,endometrio e pancreas) 2) Non sempre i tumori esprimono gli antigeni che dovrebbero caratterizzarli ( il ttf1 caratteristico degli adenocarcinomi del polmone è espresso nel 70% circa dei casi) 3) La presenza di necrosi altera l’antigenicità dei tessuti. 4) Lo stesso effetto è prodotto da non corretta fissazione e conservazione del materiale . 5) Cellule della stessa origine maligne o benigne esprimono gli stessi antigeni (la calretinina non è di aiuto nel distinguere fra mesoteli attivati e mesoteli maligni ,il cui aspetto citologico è in parte sovrapponibile)

L’accuratezza diagnostica nella determinazione dell’istotipo neoplastico si riflette su terapia e prognosi,poiché i percorsi terapeutici sono diversi per neoplasie diverse. E’ quindi doverosa la distinzione fra fra neoplasie neuroendocrine(microcitoma),adenocarcinoma e carcinoma squamoso. Anche all’interno dello stesso istotipo neoplastico si sono individuati trattamenti farmacologici differenziati,in base a alterazioni genetiche e mutazioni presenti o meno nella neoplasia. L’evidenziazione di queste alterazioni richiede l’uso di tecniche di biologia molecolare .

Indagini di biologia molecolare Analisi molecolare mediante PCR e sequenziamento diretto per ricerca mutazioni esoni 19 e 21 del gene EGFR Adenocarcinoma Analisi mediante metodica di ibridazione in situ flourescente (FISH) per riarrangiamento gene ALK Carcinoma non piccole cellule pre-trattato KRAS BRAF ROS1 quando non sono presenti altre alterazioni geniche

Cases examined N= 1117 Frequency of EGFR mutations and its subtypes. Tanaka et al. Int J Cancer. 126:651-5, 2010. 30% Mutated Wild type N= 335 Cases examined N= 1117 Exon 18 N= 9 (3%) Exon 21 (L858R/Q) N= 143 (41%) Exon 19 Deletions N= 192 (56%) 16 14 32

Cases examined N= 1390 Frequency of EGFR mutations In Italy. 264 348 384 394 Cases examined N= 1390 Frequency of EGFR mutations In Italy. 13% Mutated Wild type N= 174 Exon 21 (L858R/Q) N= 82 (47%) Exon 19 Deletions N= 86 (49%) Exon 18 N= 6 (3%) 19 33

Dott.ssa Francesca Castiglione ESONE 19 MUTATO Dott.ssa Francesca Castiglione

Dott.ssa Francesca Castiglione ESONE 19 WT Dott.ssa Francesca Castiglione

Dott.ssa Francesca Castiglione

Centro di riferimento Dott.ssa Francesca Castiglione DIPARTIMENTO DAI BIOMEDICINA SOD ISTOLOGIA PATOLOGICA E DIAGNOSTICA MOLECOLARE DIRETTORE GL.TADDEI Dott.ssa Francesca Castiglione Dott.ssa Milena Paglierani

UN FATTORE LIMITANTE NELLA DIAGNOSTICA DELLE NEOPLASIE TORACICHE E’ RAPPRESENTATO DALLA QUANTITA’ DI MATERIALE A DISPOSIZIONE. Si deve infatti ricordare che in questo tipo di diagnostica i campioni prelevati consistono o di piccole biopsie o, molto più spesso ,di materiale citologico costituito talvolta da un numero scarso di elementi cellulari. Ne conseguono sia difficoltà nella diagnostica classica sia nella applicazione di pannelli immunocitochimici ottimali, sia nel reperire materiale per biologia molecolare.

LA FASE POST-ANALITICA ALTRI REPERTI QUADRI CITOLOGICI RICONDUCIBILI A TBC ALTERAZIONI CITOLOGICHE DA VIRUS PRESENZA DI PARASSITI PRESENZA DI FUNGHI PRESENZA DI BATTERI

Agoaspirato polmonare: tubercolosi

BAL Pneumocystis carinii

Stesso caso immunocitochimica

Aspergillo . agoaspirato polmonare .strato sottile

Mucor . Lavaggio bronchiale

Mucor .lavaggio bronchiale

espettorato alterazioni cellulari da Herpes virus

Brushing tracheale alterazioni citologiche da HPV Biologia molecolare HPV 16

Lavaggio bronchiale actinomiceti

Lavaggio bronchiale actinomiceti

Un sincero grazie allo staff tecnico della U.O.di Anatomia Patologica GRAZIE PER L'ATTENZIONE Un sincero grazie allo staff tecnico della U.O.di Anatomia Patologica