RICERCA DEI MICOBATTERI NEL SANGUE

L’infezione tubercolare I micobatteri vengono liberati nell’aria, all’interno di goccioline di saliva (droplet nuclei), dai soggetti affetti da tubercolosi polmonare I droplet <5μm rimangono a lungo in sospensione nell’aria e, se inalati, possono raggiungere gli alveoli polmonari Negli alveoli i micobatteri vengono fagocitati dai macrofagi non attivati ma riescono a moltiplicarsi al loro interno uccidendoli Il processo flogistico e l’attivazione dei macrofagi riescono, nella grande maggioranza dei casi, ad arginare l’infezione con formazione del processo primario Nel 5% dei casi si instaura la malattia tubercolare (primaria) La tubercolosi (post-primaria) può manifestarsi, nel 5% degli infetti, per riattivazione del processo primario in seguito all’abbassamento delle difese immunitarie

Il Mycobacterium tuberculosis nel sangue Una breve fase batteriemica può aversi durante l’infezione primaria allorché alcuni micobatteri possono passare nel torrente circolatorio, per via linfatica, e raggiungere i distretti più disparati Una fase batteriemica prolungata si ha nelle forme disseminate (tubercolosi miliare)

Le micobatteriosi Le infezioni da micobatteri non tubercolari si acquisiscono dall’ambiente La via di ingresso può essere respiratoria o alimentare La malattia si instaura soltanto in presenza di fattori predisponenti fra le quali il principale è l’abbassamento delle difese immunitarie Forme più comuni: respiratoria (terza età) linfoghiandolare (infanzia) intestinale (AIDS) disseminata (AIDS) Nella forma disseminata si ha micobatteriemia prolungata

Breve storia dell’emocoltura per micobatteri 1917    M. C. Clough. The cultivation of tubercle bacilli from circulating blood in miliary tuberculosis. Am.Rev.Tuberc. 1932 L. Shapiro. The frequency of bacillemia in tuberculosis. Am.Rev.Tuberc. 1935 K. A. Jensen. Report on investigations regarding the Loewenstein technique of culturing tubercle bacilli from blood. Acta Tuberc.Scand. 1980 W. Landau, J. Feczko, and R. L. Kaplan. Radiometric detection of mycobacteria in routine blood cultures. J.Clin.Microbiol. 1983 J. L. Elliott, W. L. Hoppes, M. S. Platt, J. G. Thomas, I. P. Patel, and A. Gansar. The acquired immunodeficiency syndrome and Mycobacterium avium-intracellulare bacteriemia in a patient with hemophilia. Ann.Intern.Med. 1984 L. Srtockman, G. D. Roberts, and D. M. Ilstrup. Effect of storage of the Du Pont lysis-centrifugation system on recovery of bacteria and fungi in a prospective clinical trial. J.Clin.Microbiol. 1988 M. B. Agy, C. K. Wallis, J. J. Plorde, L. C. Carlson, and M. B. Coyle. Evaluation of four mycobacterial blood culture media: BACTEC 13A, Isolator/BACTEC 12B, Isolator/Middlebrook agar, and a biphasic medium. Diagn.Microbiol.Infect.Dis.

Il prelievo Campione di sangue Numero di prelievi direttamente nel flacone solo con i flaconi dedicati ai micobatteri problema dei flaconi radioattivi in assenza di flaconi dedicati in provetta (almeno 5 ml) con eparina in provetta con SPS Numero di prelievi tre, preferibilmente in giorni diversi e prima dell’inizio della terapia; ininfluente il momento del prelievo Conservazione del prelievo a temperatura ambiente, anche per alcuni giorni

Diagnostica delle micobatteriemie Esame microscopico (inutile) Esame colturale primi approcci rudimentali semina dopo lisi-centrifugazione semina diretta in terreno liquido dedicato Amplificazione genica (problematica)

La lisi-centrifugazione Anticoagulante SPS, saponina Centrifugazione per 30 min Aspirazione e scarto del supernatante Semina del sedimento su: terreno solido (possibilità di conta) terreno liquido o bifasico

I terreni liquidi per emocoltura Semina diretta BACTEC 13A BacT ALERT MB Blood BACTEC MYCO/F Lytic permette anche l’isolamento dei miceti Semina previa lisi-centrifugazione Middlebrook 7H9 BACTEC 12B BacT ALERT MP Process ESP Myco

I sistemi automatici BACTEC 460TB MB/BacT Alert 3D radiometria: liberazione di CO2 radiomarcata MB/BacT Alert 3D refrattometria: variazione dell’intensità luminosa di un raggio in seguito alla riflessione su un sensore di CO2 BACTEC, serie 9000/F fluorimetria: emissione di fluorescenza da parte di un sensore di O2 ESP II pressometria: rilevamento della diminuzione di pressione conseguente al consumo di O2

Sintesi delle procedure di laboratorio 1 Eventuale trasferimento nel flacone da emocoltura Incubazione per 60 gg. o fino al momento della positivizzazione In caso di positività strumentale preparato microscopico, per mettere in evidenza microorganismi alcol-acido resistenti in caso di positività del vetrino, semina su terreno specifico per micobatteri semina su terreno non specifico per micobatteri e non selettivo, per evidenziare eventuali contaminazioni ripresa dell’incubazione in caso di negatività del preparato e della coltura

Sintesi delle procedure di laboratorio 2 Test di ibridizzazione mediante DNA-probe sulle colonie micobatteriche cresciute nella subcoltura M. tuberculosis complex identificazione biochimica a livello di specie antibiogramma identificazione come micobatterio non tubercolare appartenente ad una delle 15 specie di più frequente isolamento identificazione come micobatterio non tubercolare non appartenente a nessuna delle 15 specie di più frequente isolamento identificazione a livello di specie mediante HPLC o test biochimico-colturali

Emocolture “non negative” Fra campioni segnalati come positivi dall’apparecchio automatico sono incluse le vere positività le “contaminazioni” le false positività transitorie

Interpretazione dei risultati Non essendo i micobatteri presenti sulla cute, in caso di positività dell’emocoltura per micobatteri, la contaminazione del campione non è ipotizzabile ed anche un solo isolamento è da ritenersi significativo

Emocolture per micobatteri eseguite negli ultimi 12 anni

Percentuali di positività

Mycobacterium avium complex

Mycobacterium tuberculosis

Altri micobatteri

Tempi di positivizzazione, in settimane

Cinetica di crescita di alcune specie micobatteriche

Infezioni micobatteriche e livello dei linfociti CD4+ M. tuberculosis MAC

Considerazioni sulla nostra casistica Le prime micobatteriemie sono comparse con qualche anno di ritardo rispetto agli USA Nei primi anni si isolava quasi esclusivamente il M. tuberculosis Repentina impennata dei MAC negli anni centrali dell’ultimo decennio del secolo scorso Nessun ritardo, per l’isolamento di altre specie micobatteriche, rispetto ad altri paesi Con l’introduzione degli inibitori delle proteasi, gli isolamenti di MAC, peraltro già in flessione, sono quasi scomparsi Ancora tutta da valutare l’inattesa impennata di isolamenti dell’ultimo anno

Coltura del sangue mestruale Sistema di elezione per la diagnosi di annessiti tubercolari Raccolta sterile problematica Alte percentuali di contaminazioni

Conclusioni Dopo gli incrementi vertiginosi degli anni ’90 la richiesta sembrava essersi stabilizzata; nell’ultimo hanno ha presentato però un brusco incremento La percentuale di positivizzazione oscilla attorno al 1% Probabilmente c’è spazio per una riduzione delle richieste, ma l’utilità dell’emocoltura per micobatteri non è in discussione Gli isolamenti di M. avium sono stati drasticamente ridimensionati dai progressi nella terapia anti-retrovirale Gli isolamenti di M. tuberculosis sono rimasti pressoché invariati Gli isolamenti di altre specie sono diventati eccezionali Non è possibile prescindere dall’impiego di terreni liquidi La consuetudine di eseguire il test su tre campioni non sembra giustificata L’ incubazione dovrebbe essere prolungata fino ad otto settimane