METODI PER LA RICERCA DI MUTAZIONI NEL DNA MODULO GENETICA METODI PER LA RICERCA DI MUTAZIONI NEL DNA Lezione III

Relazione tra condizioni patologiche umane ed elementi genetici

Test Genetici DIAGNOSTICI consentono di stabilire una diagnosi o di confermare un sospetto clinico in un individuo già affetto permettono di stabilire un’associazione tra Malattia, Gene, Mutazione Ereditaria Validità Clinica: Sensibilità probabilità che il test sia positivo in soggetti con la malattia, Specificità la probabilità che il test sia negativo in soggetti senza la malattia Linee Guida per I test genetici ISS

PRECLINICI o PRESINTOMATICI Test Genetici PRECLINICI o PRESINTOMATICI consentono di valutare se un soggetto asintomatico possa sviluppare in futuro la malattia

SUSCETTIBILITA’ GENETICA Test Genetici VALUTAZIONE DELLA SUSCETTIBILITA’ GENETICA consentono l’individuazione di genotipi che comportano un aumento di rischio a sviluppare una determinata patologia in seguito all’esposizione a fattori ambientali favorenti o alla presenza di altri fattori genetici scatenanti Linee Guida per I test genetici ISS

INDIVIDUAZIONE DEGLI ETEROZIGOTI INDAGINI MEDICO-LEGALI Test Genetici INDIVIDUAZIONE DEGLI ETEROZIGOTI in caso di patologie autosomiche recessive, finalizzate alla prevenzione della nascita degli omozigoti INDAGINI MEDICO-LEGALI consentono l’accertamento o l’esclusione di paternità e l’attribuzione di tracce biologiche a determinati individui, con un grado di probabilità molto elevato Linee Guida per I test genetici ISS

ITER PER UN TEST GENETICO Consulenza genetica pre-test Estrazione del DNA genomico da sangue periferico Analisi molecolare: PCR e sequenziamento Diagnosi Consulenza genetica post-test

ACCETTAZIONE del CAMPIONE: Fase preanalitica   ACCETTAZIONE del CAMPIONE:   Consulenza genetica   Consenso informato Nome del paziente, Data di nascita, Luogo di nascita del paziente, dei genitori e dei nonni, Origine etnica, Storia familiare (raccomandata in tutti i casi) Conoscenza dei test genetici da parte di chi richiede l’esame

Relazione tra condizioni patologiche umane ed elementi genetici

MUTAZIONI E MALATTIE GENETICHE EREDITARIE Le mutazioni sono responsabili di un gran numero di malattie ereditarie (emofilia, fibrosi cistica, distrofia muscolare, degenerazioni retiniche…) Presupposti necessari per lo studio di geni o di sequenze di interesse Isolare dall’intero genoma il tratto di DNA che si desidera studiare Ottenere molteplici copie (amplificazione) della sequenza di interesse

Tecniche utilizzate nella diagnostica molecolare CSGE PCR DGGE Sequenziamento diretto DHPLC

AMPLIFICAZIONE DEL GENE DI INTERESSE Mediante tecniche di biologia molecolare ogni “segmento” di genoma di interesse può essere amplificato sufficientemente per analizzarne in dettaglio la sequenza

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 1983 Kary Mullis scopre la reazione a catena mediata dalla polimerasi 1985 Anno della pubblicazione del primo esperimento La PCR rivoluziona la biologia molecolare

CRESCITA ESPONENZIALE n=numero di cicli Il processo, ad alta efficienza, permette di amplificare milioni di volte una sequenza specifica in 2-4 ore.

TECNICHE DI SCREENING SCREENING MANUALE PCR DGGE CSGE SEQUENZIAMENTO SSCP manuale automatico

SCREENING AUTOMATICO DHPLC

DHPLC Wild-type Paziente Wild-type Paziente

LA REAZIONE AVVIENE IN UNA SOLA PROVETTA SANGER IN AUTOMATICO dNTP ddNTP marcati Timina ddTimina + Adenina ddAdenina Guanina ddGuanina Citosina ddCitosina LA REAZIONE AVVIENE IN UNA SOLA PROVETTA Ogni ddNTP è marcato con un diverso fluorocromo

Denaturazione del prodotto di PCR SANGER IN AUTOMATICO Denaturazione del prodotto di PCR 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’

SANGER IN AUTOMATICO Annealing del primer Primer 1

SANGER IN AUTOMATICO Estensione: la DNA polimerasi inizia l’estensione del filamento a partire dall’estremità 3’ del primer in presenza di dNTPS e ddNTPS. Primer 1 DNA polimerasi

SANGER IN AUTOMATICO Estensione Primer 1 DNA polimerasi

L’elica del DNA viene estesa finchè non viene incorporato un ddNTP SANGER IN AUTOMATICO L’elica del DNA viene estesa finchè non viene incorporato un ddNTP ddNTP Primer 1

SANGER IN AUTOMATICO L’elica neosintetizzata viene rilasciata e l’elica originale è pronta per essere estesa di nuovo. ddNTP

SANGER IN AUTOMATICO Si ripete il processo : denaturazione 95° Annealing 25 CICLI Estensione 60° Primer 1

SANGER IN AUTOMATICO La sintesi procede: grazie alla incorporazione casuale dei ddNTPs vengono sintetizzate centinaia di copie di DNA, ciascuna terminante con una diversa base. Ogni frammento neosintetizzato differisce dagli altri per una base in lunghezza. Gruppo di frammenti 28 basi 27 basi 26 basi 25 basi 24 basi

SANGER IN AUTOMATICO PCR Taq e dNTPS Annealing Estensione Primer AC ACC Annealing Estensione ACCG ACCGT ACCGTA Primer A T G C Eliminazione dei ddNTPs non incorporati Elettroforesi Denaturazione Preparazione gel di acrilammide Analisi dei dati

SANGER IN AUTOMATICO Elettroforesi su gel di poliacrilammide mediante sequenziatore

SANGER IN AUTOMATICO Ognuno dei quattro ddNTPs è coniugato ad un fluorocromo di colore diverso: C, T, A, G Un laser eccita le molecole durante la loro migrazione Ogni fluorocromo emette ad una determinata lunghezza d’onda Il colore della banda che passa è registrato: i dati vengono inviati ad un computer che ne permette l’analisi

SANGER IN AUTOMATICO

* ANALISI DEI DATI ATGGCTGAAAATGCACCTG wild-type ATGGCTGAAAATGCTTCTG paziente *

ANALISI DEI DATI Wild-type Paziente R218C (652CT)

G>A: G1961E Wild-type Paziente C>A: C1177X Wild-type Paziente

Interpretazione e nomenclatura delle mutazioni 34

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ESEMPIO: nomenclatura per mutazione di splicing ivs24+1G>T

ESEMPIO: nomenclatura per mutazione missense c. 2456G>A (p.Arg869His)

ESEMPIO: nomenclatura per mutazione frameshift insC1065