CROMATOGRAFIA Tecnica di analisi e/o separazione di sostanze in miscela, basata sulla differente distribuzione delle specie da separare tra una fase mobile, (un liquido, un gas o un fluido supercritico), e una fase stazionaria immiscibile, eventualmente opportunamente supportata. In base al tipo di fase mobile e di ripartizione si distinguono vari tipi di cromatografia FASE MOBILE FASE FISSA CROMATOGRAFIA LIQUIDA (LC) liquido solido in una colonna strato sottile GAS CROMATOGRAFIA (GC) gas solido o liquido in una colonna CROMATOGRAFIA SUPERCRITICA (SFC) fluido supercritico

CROMATOGRAFIA In base al principio chimico o chimico-fisico che determina l’interazione tra il soluto o l’analita e la fase stazionaria invece si hanno: FASE FISSA SEPARAZIONE CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO solido adsorbente avviene in base alla diversa tendenza dei soluti ad adsorbirsi sulla superficie attiva dell’adsorbente in funzione della polarità della fase mobile CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE solido o liquido immiscibile con la fase mobile, supportato su un inerte avviene in base alla diversa solubilità del solito nelle due fasi CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO resina a scambio ionico avviene in base alle interazioni di tipo elettrostatico che hanno luogo tra soluto e fase stazionaria in funzione della forza ionica o del pH dell’eluente acquoso CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE setacci molecolari avviene in base alle dimensioni del soluto e alla sua tendenza ad essere trattenuto all’interno delle particelle

CROMATOGRAFIA In base alla modalità di supporto della fase stazionaria infine si ha: riempimento totale dello spazio interno la fase stazionaria è posta in una colonna CROMATOGRAFIA SU COLONNA rivestimento delle pareti interne la fase stazionaria è posta come strato sottile di materiale adsorbente su un supporto di vetro, alluminio o plastica CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE

diversa affinità dei composti da analizzare CROMATOGRAFIA diversa affinità dei composti da analizzare per la fase fissa e per la fase mobile La fase mobile viene fatta fluire a contatto con la fase stazionaria Si stabilisce una competizione tra la fase fissa e quella mobile per la ritenzione di ciascun analita La migrazione degli analiti lungo la fase fissa avviene con velocità diverse gli analiti si separano

POTERE DI TRASCINAMENTO DELLA FASE MOBILE In tutti i processi cromatografici la separazione dei componenti di una miscela si ottimizza variando degli opportuni parametri che permettono di spostare gli equilibri tra soluto, fase mobile e fase stazionaria, ovvero che influenzano le affinità relative dei soluti per le due fasi. CROMATOGRAFIA LIQUIDA COMPOSIZIONE CHIMICA POTERE DI TRASCINAMENTO DELLA FASE MOBILE GAS CROMATOGRAFIA TEMPERATURA CROMATOGRAFIA CON FLUIDI SUPERCRITICI DENSITA’

K FASI DEL PROCESSO CROMATOGRAFICO Caricamento del campione all’inizio della fase stazionaria Eluizione della miscela con la fase mobile Rivelazione dei composti separati K natura del soluto Distribuzione del composto tra le due fasi coefficiente di ripartizione natura della fase stazionaria dipende da natura della fase mobile costante di distribuzione K = concentrazione del soluto nella fase stazionaria concentrazione del soluto nella fase mobile

concentrazione del soluto nella fase stazionaria coefficiente di ripartizione per ciascun componente della miscela K = costante di distribuzione concentrazione del soluto nella fase mobile soluto tempo di permanenza nel sistema tM  tempo morto: tempo impiegato dall’eluente per percorrere la fase stazionaria Intensità Tempo A B tR  tempo di ritenzione assoluto: tempo impiegato dalla sostanza per percorrere la fase stazionaria t’R  tempo di ritenzione corretto: t’R = tR - tM tM tR tR dipende da K

INDIPENDENTE DALLE CONDIZIONI SPERIMENTALI tempo di ritenzione RELATIVO rapporto tra i tempi assoluti del soluto e di una sostanza di riferimento differenza tra i tempi di ritenzione tra due specie (somma delle larghezze dei picchi a metà altezza) : 2 RISOLUZIONE = indicazione quantitativa della capacità di separazione di un sistema cromatografico R = [tRB - tRA] (WhB - WhA)/2 = 2 . [tRB - tRA] (WhB - WhA)

R k’ = (tR - tM)/tM a = k’B/k’A N = 16 (tR/ Wb)2 n = 5.54 (tR/ Wh) fattore di capacità k’ = (tR - tM)/tM affinità di un composto per la fase stazionaria (velocità di migrazione) non dipende dalle condizioni analitiche, meglio di tR k’  ritenzione  R dipende da fattore di separazione a = k’B/k’A selettività: separazione di due sostanze in funzione del rispettivo fattore di capacità efficienza N = 16 (tR/ Wb)2 n = 5.54 (tR/ Wh) capactà di un sistema di minimizzare il BROADENING delle bande cromatografiche numero dei piatti teorici

diametro delle particelle spazio della colonna nel quale si attua l’equilibrio di ripartizione del soluto tra fase fissa e fase mobile PIATTO TEORICO CIOE’ nel piatto teorico il soluto è presente nella fase fissa e nella fase mobile alla concentrazione di equilibrio + SEPARAZIONE + EFFICIENZA + PIATTI TEORICI + EQUILIBRI dipende da diametro delle particelle HETP = L/N - HETP velocità di flusso natura del supporto + PIATTI TEORICI

Un modello più realistico per descrivere i processi di equilibrio durante una separazione cromatografica si basa sul TEMPO necessario per lo stabilirsi dell’equilibrio di ripartizione del soluto tra le due fasi. Diventa quindi importante la VELOCITA’ di eluizione. troppo bassa aumenta il BROADENING VELOCITA’ tempo di contatto troppo breve perché si instauri un equilibrio efficace troppo alta VELOCITA’ LINEARE OTTIMALE MASSIMA EFFICIENZA

HETP = A + B/u + Cu EQUAZIONE DI VAN DEEMTER u cm/s HETP = A + B/u + Cu Equazione di Van Deemter trasferimento di massa diffusione a vortice diffusione longitudinale A  diffusione microvorticosa B  diffusione molecolare longitudinale C  resistenza al trasferimento di massa u  velocità lineare media del fluido di trasporto

Ciò che parte assieme arriva in tempi diversi Diffusione vorticosa (A) all’interno della fase fissa sono possibili vari cammini per le molecole e non tutti hanno la stessa lunghezza. Ciò che parte assieme arriva in tempi diversi Diffusione vorticosa (A) la concentrazione dell’analita è maggiore al centro della banda rispetto alla periferia, quindi il soluto tende a migrare. Tempi di contatto brevi (= velocità alta  minore broadening). Diffusione longitudinale (B): tempi di contatto brevi  scarso equilibrio tra soluto e fase stazionaria  maggiore broadening Trasferimento di massa (C): influiscono su AMPIEZZA DELLA BANDA quindi su A, B, C HETP

colonne più lunghe impaccamento meno uniforme contropressione più bassa Dimensione delle particelle colonne più corte impaccamento più efficiente (meno cunicoli) contropressione più alta

RISOLUZIONE R = 2 . [tRB - tRA] (WhB - WhA) da R = N/4 . [(a-1)/a] . [k’/(1+k’)] N  n.ro dei piatti teorici tR  tempi di ritenzione a  fattore di selettività Wh  larghezza a metà altezza k’  fattore di ritenzione aumentare il numero dei piatti teorici allungare la colonna ridurre l’HETP diminuendo la dimensione delle particelle variando T (GC) PER MASSIMIZZARE R modificare k’ variando la composizione della fase mobile (LC) modificare a variando T variando la composizione della fase mobile variando la composizione della fase stazionaria usando accorgimenti (complessanti, basi,…)