Elettroforesi di Acidi Nucleici Southern e Northern Blot Corso di Biologia Molecolare II a.a. 2006-2007 Elettroforesi di Acidi Nucleici Southern e Northern Blot Ubaldo Gioia

ELETTROFORESI SU GEL Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA da una miscela complessa E’ una tecnica fondamentale per: l’analisi (elettroforesi analitica) la purificazione degli acidi nucleici (elettroforesi preparativa)

catodo anodo - + RNA e DNA sono carichi negativamente

Effetto “setaccio” in un gel uniforme - +

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO L’agarosio è un polisaccaride costituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6-anidro-L-galattosio.

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO Consente la separazioni di molecole di grandi dimensioni: 0.1 - 20 kb 0.8% : 0.5 – 20 kb 2% : 0.1 – 3 kb Concentrazione di agarosio Risoluzione

Come si prepara un gel d’agarosio Si scioglie l’agarosio in polvere in una soluzione tampone a 100°C Alla soluzione d’agarosio si aggiunge Etidio Bromuro (EtBr)

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO generatore di corrente 100V 0,2A tampone elettroforetico Polo - Polo + scatola elettroforetica gel di agarosio 1.2%

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO 100V 0,2A Polo - Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO ON 100V 0,2A Polo - Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO ON 100V 0,2A Polo - Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.

Etidio Bromuro (EtBr): colorante fluorescente assorbe la luce UV a 300 nm dando colore giallo-arancio E’ utile sia per visualizzare, sia per quantificare il campione: l’intensità della fluorescenza è, infatti, proporzionale alla quantità del campione.

Per frammenti lineari di DNA e/o RNA la distanza di migrazione è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola (ovvero alla sua lunghezza in basi)

Conoscendo la distanza di migrazione di frammenti di dimensione nota (M) posso “interpolare” la lunghezza delle molecole A e B A = 2.5 kb B = 6 kb Dai Geni ai Genomi -EdiSES-

Non tutte le molecole di DNA sono lineari (es.: plasmidi batterici) pBR322 plasmide circolare “rilassato” migra più lentamente rispetto ad un DNA lineare o superavvolto della stessa massa nick plasmide superavvolto Sebbene le due forme abbiano le stesse dimensioni, esse migreranno in maniera differente pBR322 pBR322 dopo digestione plasmide “linearizzato”

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI NB Gli acidi nucleici a singolo filamento (come l’RNA) tendono a formare complesse strutture secondarie, pertanto la loro “corsa elettroforetica” è fortemente influenzata dal modo in cui si ripiegano. NB L’RNA prima di essere separato per elettroforesi deve essere prima denaturato, al fine di mantenere le molecole in forma lineare Agenti denaturanti comunemente usati: calore, formaldeide, formammide, urea

Separazione in gel d’agarosio di molecole di RNA in condizioni denaturanti 28S (3400 nt) 18S (1800 nt) Per ottenere una buona separazione dei pesi molecolari durante la corsa nel gel, l’RNA deve essere denaturato, ossia le molecole devono essere liberate sia da appaiamenti con altre molecole sia da strutture secondarie intramolecolari. La denaturazione si ottiene “scottando” (90-95°C) il campione e aggiungendo formaldeide al gel. Anche il loading dye contribuisce alla denaturazione poichè contiene formaldeide e formammide.

ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDE (PAGE) Separazione di frammenti minori di 1 kb Permette di separare frammenti che differiscono di una sola base (determinazione della sequenza del DNA)

Formazione di un gel di poliacrilammide

ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDE (PAGE) Spessore del gel 0,4-1,5 mm Il gel è composto da acrilamide e bis acrilamide in un rapporto caratteristico 29:1 che determina lo spessore dei pori. Esso inoltre contiene urea che funziona da denaturante. acrilamide/bis acrilamide 29:1 (6-15%)+ 7M Urea Risoluzione: 20 - 1000 nt

1000V 22 mA Polo - Polo +

Separazione di RNA totale 1000V 22 mA ON 5.8SL(circa 150 nt) 5S (circa 120 nt) pre-tRNAs/ tRNAs (circa 80 nt) 5.8SS Separazione di RNA totale dopo PAGE 6% Polo - Polo +

1000V 22 mA RNA circolare

RIASSUMENDO

Blotting di Acidi Nucleici: Southern e Northern Blot Permettono di studiare: Struttura ed organizzazione del genoma Regolazione dell’espressione genica Elettroforesi su gel Trasferimento (blotting) su membrana Ibridazione con una sonda marcata radioattivamente