Tramite ELETTROFORESI dimensione , carica o idrofobicita’ relativa. Analisi elettroforetica delle proteine CAPITOLO 10 nuovo testo Capitolo 12 vecchio testo. Tramite ELETTROFORESI le proteine si possono separare in base a una o piu’ delle seguenti caratteristiche : dimensione , carica o idrofobicita’ relativa.

Perché si usa una matrice solida per alcuni tipi di elettroforesi? La separazione elettroforetica si effettua su una matrice solida poiché durante la migrazione in un campo elettrico si generano forze convettive e di diffusione Da cosa sono generate queste forze?

Le proteine sono cariche ad un pH differente dal loro punto isoelettrico   Punto isoelettrico (pI) e’ il valore di pH al quale il numero delle cariche negative sulla molecola prodotta dalla ionizzazione del gruppo carbossilico risulta uguale al numero delle cariche positive acquisite dal gruppo amminico

Al punto isoelettrico la molecola e’ elettroforeticamente immobile . Le molecole cariche migrano in un campo elettrico in maniera dipendente dalla loro densita’ di carica. Al punto isoelettrico la molecola e’ elettroforeticamente immobile . Una proteina carica che è posta in un campo elettrico ha una distanza di migrazione proporzionale sia alla intensità di corrente (I) che al tempo (t ).

La corrente nella soluzione tra gli elettrodi e’ condotta principalmente dagli ioni del tampone di corsa e solo in piccola parte dagli ioni del campione. La legge di Ohm esprime la relazione tra corrente (I), voltaggio (V), e resistenza (R): R = V / I SI può quindi accellerare una separazione elettroforetica aumentando il voltaggio applicato, MA…….

Aumentando il voltaggio necessariamente si genera CALORE Durante l’elettroforesi la potenza (W= watts) generata nel mezzo di supporto e’ data da : W = I2 R R= resistenza I= intensità della corrente La maggior parte della potenza sviluppata durante elettroforesi viene dissipata in calore

Problemi derivanti dallo sviluppo di calore durante elettroforesi. 1.Maggiore tasso di diffusione del campione e degli ioni del buffer =allargamento delle bande da separare 2. Formazione di correnti convettive =possono causare un miscelamento del campione 3. Instabilita’ termica dei campioni=denaturazione delle proteine sensibili al calore conseguente perdita di attivita/folding 4.Diminuita viscosita’ del buffer = riduzione della resistenza del mezzo

i pori sono formati da molecole di polisaccaridi Gel di agarosio i pori sono formati da molecole di polisaccaridi che partecipano alla formazione di strutture a doppia elica Questi pori non hanno una struttura regolare la dimensione dei pori si controlla variando la concentrazione di agarosio: piu’ grande e’ il numero delle eliche formate per unita’ di spazio e piu’ piccola sara’ la dimensione media dei pori ,

Gel di poliacrilammide: miscela di bis e monoacrilammide Una singola molecola di bis acrilammide e’ essenzialmente formata da due molecole di acrilammide unite da un gruppo metilico.

La poliacrilammide polimerizzata ha matrice molto regolare con pori di dimensioni uniformi I monomeri di acrilammide formano catene e le molecole di bis-acrilammide danno i metili che formano i ponti cross-lincanti

Il radicale libero (R*= SO4- . ) La polimerizzazione della acrilammide avviene in presenza di TEMED e AMMONIO PERSOLFATO TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione di un radicale libero SO4- . =R* S2O82+ + e- SO42- + SO4- . Il radicale libero (R*= SO4- . ) è una molecola con un elettrone spaiato R* sono specie molto reattive. Occasionalmente si procede alla degassazione della acrilammide mix poiche’ l’ ossigeno rimuove i radicali

reagisce con M (monomero di acrilammide) Durante le polimerizzazione Il radicale libero (R*= SO4- . ), che è una molecola con un elettrone spaiato, reagisce con M (monomero di acrilammide) R*+M RM*+M RMM* e forma un legame singolo condividendo il suo elettrone spaiato con uno proveniente dal guscio esterno della molecola del monomero …e così via

PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) Separazione dellle proteine tra 5 to 2,000 kDal e’ stata introdotta da by Raymond and Weintraub (1959). . La dimensione dei pori si puo’ controllare variando la percentuale di acrilammide e/o Bis-acrilammide (da 3% a 30%),

SDS –PAGE (gel denaturante) Il detergente anionico SDS = CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+ Il detergente anionico SDS distrugge i legami idrogeno, blocca le interazioni idrofobiche e sostanzialmente denatura le molecole proteiche minimizzando così le differenze dovute alla forma molecolare eliminando le strutture secondarie e terziarie. http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/SDSPAGE/SDSPAGE.html#SDS Le proteine possono essere completamente denaturate quando sostanze riducenti quali DTT e’ utilizzato insieme al SDS.

1.4g SDS per grammo di proteina La maggioranza delle proteine lega 1.4g SDS per grammo di proteina Il legame del SDS alle proteine causa un’ efficace mascheramento delle cariche intrinseche della catena polipeptidica e apporta una carica netta negativa proporzionale alla lunghezza del polipeptide

SDS-PAGE il miscuglio proteico si separa secondo l’effettivo raggio molecolare (Mr) di ciascuna proteina, che e’ approssimativamente uguale alla dimensione molecolare di ciascun polipeptide. risultato sarà la separazione delle proteine per setacciamento attraverso i pori del gel di poliacrilammide http://www5.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/Elpho_1D_SDS+PAGE

TAMPONI usati per SDS-PAGE Esistono due tipi di sistemi di buffers: continui e discontinui TAMPONI usati per SDS-PAGE

Buffer discontinuo di Ornstein and Davis (1964) modificato da Laemnli Laemmli buffer E’ il piu’ comune buffer utilizzato per SDS-PAGE gels Caricamento Stacking run Separating Laemmli buffer e’ costituito da a) Stacking (o gel di impaccamento) con grandi pori b)Separating gel (12%, 10%, 6% etc.). I

ha pori di grandi dimensioni Stacking gel ha pori di grandi dimensioni (4% acrilammide) che permettono alle proteine di muoversi liberamente e di concentrarsi sotto l’ effetto del campo elettrico. RUN Loading Lo scopo del gel di impaccamento è di concentrare le proteine in un banda sottile prima che ilcampione entri nel gel separatore

NELLO STACKING GEL Una volta applicata la corrente.. le bande di proteine si assottigliano a causa del fatto che gli ioni di glicinato (carichi -) presenti nel tampone elettroforetico hanno mobilità elettroforetica più bassa dei complessi proteina-SDS ioni di glicinato<complessi proteina-SDS< ioni cloruro (Cl-) I complessi proteina-SDS a loro volta hanno una mobilità elettroforetica, inferiore a quella degli ioni cloruro (Cl-) presenti nel tampone di caricamento (sample buffer)

Il gel di separazione (separating gel) ha pH 8.8 mentre quello di impaccamento (stacking gel) ha pH 6.8. Separazione Separating gel Raggiunto il gel di separazione, il glicinato a causa dell’ ambiente a pH maggiore diventa completamente ionizzato e cresce la sua mobilita’elettroforetica

peso molecolare (MW=kDal) Il risultato e’ che nel gel separante i complessi proteins_SDS (carichi negativamente) si muovono verso il polo positivo in funzione del setaccio molecolare operato dal gel di poliacrilammide quindi in funzione del loro peso molecolare (MW=kDal) -180 -65 -20 Cioè : le proteine piu’ piccole migreranno piu’ velocemente di quelle piu’ grandi a che saranno rallentate da resistenze frizionali

ALTRI TIPI DI GEL DI POLIACRILAMMIDE a) GEL NATIVO SDS è assente e le proteine non vengono denaturate prima del caricamento Le proteine migrano in dipendenza della loro carica b) GEL a GRADIENTE (tipicamente 5% a 25% ) Permette una maggiore separazione delle proteine con massa simile

Rilevazione delle proteine su gel

interazioni elettrostatiche dei gruppi sulfonici del colorante. con Comassie Blue Il colorante Comassie brilliant blue-G250 (CBB) si lega alle proteine tramite interazioni elettrostatiche dei gruppi sulfonici del colorante. La colorazione CBB visualizza bande con una concentrazione di circa 0.1µg di proteina.

Silver staining

Western blotting trasferimento su membrana di nitrocellulosa (NC) o polyvinylidene fluoride (PVDF) delle proteine separate tramite elettroforesi

APPARATI di traferimento Liquido e SEMI-DRY

APPARATO DI TRASFERIMENTO Semi-dry 3MM   Direzione di migrazione

Nel semi-dry si suggerisce di applicare 1mA/cm2 di membrana  Corrente applicata Nel semi-dry si suggerisce di applicare 1mA/cm2 di membrana in ogni caso mai piu’ di 5mA/cm2 senza refrigerazione! Attenti alle bolle d’aria e all’essicamento della membrana

BUFFER di TRASFERIMENTO : Ruolo del metanolo e del SDS. Il metanolo presente nel buffer fa : 1. decrescere la mobilita’ delle proteine durante l’ elettroforesi. dissociare l’ SDS dalle proteine aumentare le interazioni idrofobiche tra proteine e membrana. Denaturare le proteine ad alto peso molecolare e quindi rende il loro passaggio dal gel alla membrana piu’ difficile. Le proteine piccole non sono invece influenzate dalla presenza di metanolo.

L’SDS da una carica negativa alla proteina aiuta il traferimento delle proteine dal gel alla membrana NOTA CHE: L’ SDS agisce in maniera opposta al metanolo per quel che rigurda il suo effetto sulla quantità di proteina che viene traferita dal gel alla membrana

Per migliorare il legame delle proteine con la membrana si puo’ aumentare la concentrazione di metanolo (normalmente tra 10%-20%) oppure ridurre la sua concentrazione se le proteine rimangono nel gel. Un’alta concentrazione di SDS, sebbene faciliti il trasferimento, può interferire con il legame delle proteine alla membrana

APPARATI di traferimento Liquido Piu’ tempo le proteine sono a contatto con la membrana e piu’ facilmente vi si legheranno Apparato liquido +buffer +tempo di corsa rispetto ad un semi-dry Quando si usa? A) Si devono trasferire proteine ad alto peso molecolare poichè necessitano di piu’ tempo per essere trasferite e di maggiori quantita’ di buffer B) Le proteine sono corse su gel ad alta concentrazione di acrilammide o molto spessi.

I tempi di trasferimento variano in dipendenza dalla dimensione delle proteine da trasferire, tipo di membrana e tipo di apparato per blotting utilizzato semi-dry : max 2h o liquido : fino a 28h Tempi di trasferimento

TIPI di MEMBRANE per il trasferimento di proteine: Le membrane di PVDF lega le proteine principalmente attraverso interazioni idrofobiche. sono comunemente usate per la loro i resistenza chimica e per la stabilita’ fisiologica. La nitrocellulosa (NC) lega le proteine primariamente tramite interazioni elettrostatiche o idrofiliche

Membrane PVDF : legano le proteine principalmente attraverso interazioni idrofobiche. Esistono diversi tipi di membrane PVDF Diversa porosità e resistenza Membrane derivate con procedure che aggiungono cariche alla membrana PVDF in modo da permettere oltre che interazioni idrofobiche anche interazioni elettrostatiche. Membrane PVDF derivate sono per esempio usate per legare DNA o RNA o per procedure di purificazione a scambio ionico delle proteine .

MEMBRANE DI NITROCELLULOSA (NC) Sono meno sensibili della PVDF alle concentrazioni di SDS (eg. danno meno “background signal” ) perchè legano le proteine primariamente tramite interazioni elettrostatiche o idrofiliche. L’ SDS, coprendo le cariche delle proteine, puo’ impedire la formazioni di legami idrofobici con la PVDF ma non interferisce con la formazione deli legami elettrostatici con la NC. Proteine che sono scarsamente trasferibili possono essere meglio trasferite poiche’ si puo’ utilizzare SDS nel buffer di traferimento (normalmente questo non e’ presente o e’ controproducente) . La maggiore limitazione della nitrocellulasa e’ la sua scarsa capacita’ di legare proteine con basso peso molecolare e la fragilità SVANTAGGI

PRO e contro la PVDF rispetto alla NC. La PVDF e’ meglio per: il trasferimento di proteine a basso peso molecolare perchè lega piu’ fortemente le proteine ma 1) e’ piu’ sensibile alla presenza di impurita’ presenti nel buffer (compreso SDS, glicina e Tris) la presenza di queste sostanze sulla membrana puo’ dare origine ad un alto “background”. 2) e’ piu’ difficile eluire le proteine da PVDF quindi meglio NON usare PVDF in procedure che implicano la eluizione della banda proteica dalla membrana