Sequenziamento enzimatico del DNA (Sanger) T G C A
5’ 3’ TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT 5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT 5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCA 5’ 3’
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT 5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCA
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT 5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCA dATP dCTP dGTP dTTP + DNA Polimerasi
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT 5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT
TTACGTAACGTCAGAACGTCCGGAACGTAGGGGTCGCGCGTT 5’ 3’ AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA 3’ 5’ TTACGTAACGTCA dA dC dG dT + DNA Polimerasi ddATP ddCTP ddGTP ddTTP dATP dCTP dGTP dTTP + DNA Polimerasi
TTACGTAACGTCAG 14 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGA 15 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAA 16 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAAC 17 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACG 18 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACGT 19 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA TTACGTAACGTCAGAACGTC 20 AATGCATTGCAGTCTTGCAGGCCTTGCATCCCCAGCGCGCAA
- Elettroforesi Laser Fluorimetro +
A C G T - Elettroforesi Lettura G Laser Fluorimetro +
A C G T - Elettroforesi Lettura GAAC Laser Fluorimetro +
Elettroferogramma
Sequenziamento enzimatico del DNA (Sanger) T G C A
Metodi di marcatura degli acidi nucleici
Traccianti utilizzati Nucleotidi marcati con isotopi radioattivi
Traccianti utilizzati Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive
Traccianti utilizzati Nucleotidi marcati con sostanze non radioattive Fluorocromi (marcatura diretta) Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina) Digossigenina (riconosciuta da anticorpi specifici marcati con fluorocromi o enzimi) Biotina (riconosciuta da avidina marcata con fluorocromi o enzimi)
Traccianti utilizzati Fluorocromi
Strategie di marcatura Marcatura delle estremità mediante polinucleotide chinasi
Strategie di marcatura Sintesi di DNA mediante random priming
Strategie di marcatura Nick Translation 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ DNAsi I E. Coli Pol I Attività esonucleasica 5’-3’ + nucleotidi marcati Attività polimerasica 5’-3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’
Strategie di marcatura PCR 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ Vantaggi: elevata attività specifica, necessarie poche molecole di stampo
Strategie di marcatura Sintesi di RNA antisenso mediante RNA polimerasi
Strategie di marcatura Sintesi di cDNA mediante transcrittasi inversa
Tecniche di rivelazione degli acidi nucleici basate su ibridazione dopo separazione elettroforetica mediante gel di agarosio. Il Southern blot analizza il DNA, il Northern blot l’RNA.
Strategia generale
Altra forma di ibridazione su membrana: il dot blot (sia con campioni di RNA che di DNA) 1 1 2 3 4 2 5 6 7 8 3 9 10 11 12 4 13 14 15 16 Dot blot
Preparazione dei campioni prima della corsa elettroforetica Nel southern blot il DNA (sia genomico che plasmidico) viene digerito con enzimi di restrizione. Nel northern l’RNA deve essere denaturato. Si può usare RNA totale o RNA messaggero purificato (PolyA+)
Cella elettroforetica per gel di agarosio
- + DNA genomico RNA totale mRNA M E6 E4 28S 18S DNA satellite 7S 10 9 5 4 3 18S 2 DNA satellite 1 7S +
Trasferimento capillare da gel di agarosio
Trasferimento elettrico da gel di agarosio
Membrana dopo trasferimento
Marcatura della sonda tramite random priming
SOUTHERN BLOT
RFLP= restriction fragment length polymorphism
Individuazione diretta di mutazioni patogene tramite identificazione di RFLP In rari casi la mutazione patogena può abolire o creare un sito di restrizione
I polimorfismi delle VNTR (Variable number of Tandem Repeat) -DNA genomico viene digerito con enzimi ben conservati che Fiancheggiano uno specifico locus VNTR. -Lo schema di RFLP non dipende da RSP, bensì da numero di volte un cui una unità è ripetuta in tandem -sonda: sequenza unica del locus
DNA FINGERPRINT (impronta digitale del DNA) -Se il locus VNTR fa parte di una famiglia di DNA ripetitivo, si può usare come sonda una unità ripetuta, al posto di una seq unica del locus -Si produce uno schema polimorfico complesso che permette di discriminare tra due individui qualsiasi che non siano gemelli identici